基于HPLC多指標成分測定及指紋圖譜多模式識別方法的北細辛質量分析

李 妍，何文媛，王康宇，白羽辛，高文義，貢濟宇

基于HPLC多指標成分測定及指紋圖譜多模式識別方法的北細辛質量分析

李 妍，何文媛，王康宇，白羽辛，高文義*，貢濟宇*

長春中醫藥大學藥學院，吉林 長春 130117

通過HPLC多成分含量測定與指紋圖譜的多模式化學識別方法對北細辛var.進行不同產地質量分析研究，為北細辛藥材質量評價提供參考。收集了4個產區的18批細辛樣品，采集HPLC指紋圖譜并進行3種有效成分的含量測定，通過聚類分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）分別探討不同產區北細辛的質量。建立了北細辛藥材的指紋圖譜，確定共有峰17個，指認了3個共有峰。甲基丁香酚、芝麻脂素、細辛脂素的質量分數分別為1.76～32.98、1.03～6.05、1.59～6.91 mg/g。CA可將4個產地北細辛藥材聚為2類，PCA結果提取了2個主成分，OPLS-DA能有效地將2大產區藥材明顯地區分開。通過北細辛HPLC含量測定與指紋圖譜建立的多模式識別法全面評價了北細辛的質量，為北細辛藥材質量評價提供依據，可作為北細辛質量控制的有效方法。

細辛；HPLC；指紋圖譜；化學模式識別；質量評價；甲基丁香酚；芝麻脂素；細辛脂素

細辛是一味臨床常用中藥，首載于《神農本草經》[1]，《中國藥典》2020年版記載細辛為馬兜鈴科植物北細辛Fr. Schmidt var.(Maxim.) Kitag.、漢城細辛Miq. var.Nakai或華細辛Miq.的干燥根和根莖，其味辛、性溫、歸心、肺、腎經，具有解表散寒、祛風止痛、通竅、溫肺化飲的功效。可用于風寒感冒、頭痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻軌、鼻淵、風濕痹痛、痰飲喘咳[2]。其中北細辛主要分布在吉林、遼寧、黑龍江一帶。根據細辛最新藥理研究進展，細辛具有對中樞神經系統的作用，以及鎮痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抗衰老、保護心血管等作用，其臨床效果顯著，具有重要的研究價值。明代李時珍《本草綱目》[3]記載：“承曰：細辛···若單用末，不可過一錢，多則氣悶塞不通者死，雖死無傷。···非本有毒，但有識多寡耳。”近些年關于細辛中馬兜鈴酸致腎毒性的報道越來越多，在臨床上正確合理運用細辛也越來越重要。

中藥材產區直接影響藥材的質量以及有效成分的含量，也可能對其毒性有一定的影響，王志清等[4]通過對遼寧、吉林、黑龍江3個產地的北細辛進行了含量測定，其結果顯示樣品間的有效成分含量差異主要是來自樣品自身光合產物次生代謝與合成的差異，其中細辛揮發油成分為苯丙烷類化合物，苯丙烷類化合物的次生代謝與光照強度強弱有關[5]，因此，細辛揮發油含量是受環境條件和遺傳基因雙重影響的。曹晨等[6]通過ICP-AES和ICP-MS測定不同產地的無機元素，表明不同產地的細辛藥材中無機元素差異較大。也進一步闡明了不同產區對中藥材的影響差異較大。但目前沒有一種手段來全面而準確地反映不同產區細辛藥材的差異。

近年來，中藥指紋圖譜與化學模式識別相結合，已成為目前最常用最有效的控制天然藥材質量的手段[7]。本研究收集遼寧、吉林2大主產區北細辛藥材，共計18批藥材樣品，通過指紋圖譜、有效成分的含量測定與聚類分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等化學模式識別法對北細辛不同產地進行質量分析研究，為多指標的復雜含量測定與指紋圖譜相結合的方法評價不同產地藥材質量提供有效的參考，同時也為其他道地藥材產地質量評價提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2030型高效液相色譜儀（DGC-20A型在線脫氣系統，SIL-20A型自動進樣系統，UV檢測器，日本島津公司），AB135-S型1/10萬電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），AL204型1/1萬分之一電子天平型（瑞士梅特勒-托利多公司），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），TGL16E型臺式高速冷凍離心機（長沙英泰儀器有限公司），GR1508型粉碎機。

1.2 試劑

對照品細辛脂素（批號P11D8S50449，質量分數≥98%）、芝麻脂素（批號KS0927CB14，質量分數≥98%）購買于上海源葉生物科技有限公司；甲基丁香酚對照品（供含量測定使用，批號111642-200301）購買于中國藥品生物制品檢定所；乙腈（Fisher公司，色譜純）；屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；其余試劑均為分析純。

收集4個不同產地的18批細辛藥材，經長春中醫藥大學中藥鑒定教研室蔡廣知副教授鑒定為馬兜鈴科植物北細辛Fr. Schmidt var.(Maxim.) Kitag.的干燥根和根莖。藥材信息見表1。

表1 北細辛藥材信息

Table 1 Information table of A. heterotropoides var. mandshuricum

編號產地批號 S1遼寧新賓XX180321 S2遼寧新賓XX180323 S3遼寧新賓XX180325 S4遼寧新賓XX180324 S5遼寧鞍山1709062 S6遼寧鞍山1709063 S7遼寧鞍山1709061 S8遼寧鞍山1709064 S9吉林通化JLT20190803 S10吉林通化JLT20190802 S11吉林通化JLT20190804 S12吉林通化JLT20190801 S13吉林通化JLT20190805 S14吉林靖宇JLJ01 S15吉林靖宇JLJ02 S16吉林靖宇JLJ03 S17吉林靖宇JLJ04 S18吉林靖宇JLJ05

2 方法與結果

2.1 色譜條件

依利特C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-水（B）；梯度洗脫：0～10 min，5%～16% A；10～15 min，16%～27% A；15～35 min，27%～37% A；3～50 min，37%～43% A；50～60 min，43%～52% A；60～70 min，52%～54% A；柱溫為30 ℃；檢測波長為287 nm；進樣量為10 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取各對照品細辛脂素、芝麻脂素、甲基丁香酚適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成分別含細辛脂素0.103 4 mg/mL、芝麻脂素0.102 0 mg/mL、甲基丁香酚0.100 0 mg/mL的混合對照品儲備液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取細辛藥材粉末（三號篩）約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率500 W、頻率40 kHz）45 min，放冷，用甲醇補足減失的質量，13 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.3 細辛指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗 取細辛藥材S9，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，照上述“2.1”項下色譜條件進行HPLC分析，連續進樣6次，以甲基丁香酚（12號色譜峰）為參照蜂，計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果表明各色譜峰的相對保留時間RSD值均小于2.8%，相對峰面積的RSD值均小于4.0%。

2.3.2 穩定性試驗 取細辛藥材S9，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別在0、2、4、8、10、12 h后按照“2.1”項下色譜條件進樣分析，以甲基丁香酚（12號色譜峰）為參照蜂，計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果表明各色譜峰的相對保留時間RSD值均小于1.8%，相對峰面積的RSD值均小于4.7%。

2.3.3 重復性試驗 取細辛藥材S9，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，照上述“2.1”項下色譜條件進行HPLC分析，以甲基丁香酚（12號色譜峰）為參照蜂，計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果表明各色譜峰的相對保留時間RSD值均小于2.1%，相對峰面積的RSD值均小于4.9%。

2.3.4 HPLC指紋圖譜的建立 分別取18批樣品按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，得到18批細辛藥材的HPLC色譜圖。將18批樣品色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》進行分析，以S1為參照圖譜，采用平均數法譜峰多點校正生成細辛圖譜，見圖1。其中確定共有峰有17個，通過與混合對照品溶液的色譜圖（圖2）比對，指認出3個成分，分別為甲基丁香酚（12號峰）、芝麻脂素（13號峰）、細辛脂素（15號峰），18批細辛藥材HPLC指紋圖譜見圖1。

圖1 18批北細辛藥材HPLC指紋圖譜

12-甲基丁香酚 13-芝麻脂素 15-細辛脂素

2.4 相似度評價

將18批細辛樣品色譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》進行分析，計算相似度，結果見表2。18批細辛樣品色譜圖與對照圖譜的相似度為0.900～0.970，說明18批細辛樣品的整體質量較穩定。

表2 18批北細辛樣品指紋圖譜相似度評價結果

Table 2 Similarity calculation results of 18 batches of A. heterotropoides var. mandshuricum

藥材編號相似度藥材編號相似度 S10.925S100.919 S20.900S110.933 S30.901S120.916 S40.934S130.925 S50.967S140.921 S60.965S150.903 S70.941S160.912 S80.970S170.903 S90.915S180.907

2.5 CA

采用SPSS 25統計軟件對細辛進行CA，將18批細辛的相對共有峰峰面積導入到SPSS 25統計軟件，以組間聯接法及皮爾遜相關性作為分類依據獲得分析結果，見圖3。當分類距離為18時，18批細辛分為2類，第1類為S1～S8，其S1～S8均為遼寧地區的細辛藥材；第2類為S9～S18，這10批樣品均為吉林地區的細辛藥材；當分類距離為8時，18批藥材可分為4類，第1類為S1～S4，這4批均為遼寧新賓產區的細辛藥材；第2類為S5～S7，均為遼寧鞍山產區的藥材；第3類為S14、S17、S18，均為吉林靖宇產區的細辛藥材；第4類為S9～S13、S15、S16，其中S9～S13為吉林通化產區的細辛藥材，S15、S16為吉林靖宇產區的細辛藥材。這說明遼寧產區和吉林產區的細辛藥材具有明顯的差異。

圖3 18批北細辛樣品CA圖

2.6 PCA

將18批細辛共有峰峰面積導入SIMCA 13.0軟件進行PCA，得分矩陣圖（2為0.916，2為0.653）見圖4。從得分圖來看，18批樣品聚類效果不是很明顯，軸以上的10批藥材為吉林產區的細辛藥材；軸以下的8批藥材為遼寧產區的細辛藥材，其中位于第3象限的S5～S8為遼寧鞍山的細辛藥材，位于第4象限的S2～S4為遼寧新賓的細辛藥材，其中S1較為特殊。從整體來看說明18批細辛藥材存在一定的差異。

2.7 OPLS-DA

以18批細辛樣品共有峰峰面積為變量，導入SIMCA13.0軟件進行OPLS-DA，得分矩陣圖見圖5。該OPLS-DA模型，2＝0.905，2＝0.813，均大于0.5，說明模型穩定可靠，可用于不同產區樣品的分析。從得分圖來看，2類樣本點完全被分開，樣本點之間沒有交叉。18批樣品分為2類，S1～S8號樣品聚為一類均為遼寧產區細辛藥材，S9～S18號樣品聚為一類均為吉林產區細辛藥材。

結合變量重要性投影值（variable importance in the projection，VIP）見圖6，采用VIP值的判定方法篩選差異組分，以VIP＞1.0作為標準篩選出對模型上2組間分類貢獻較大的8個變量，依次為1號峰、12號峰（細辛脂素）、2號峰、5號峰、8號峰、6號峰、7號峰、13號峰（芝麻脂素）是引起細辛不同產區間成分差異的主要標志性成分，其余峰VIP值小于1，對樣品的區分影響較小。

圖4 18批細辛藥材PCA得分

圖5 18批細辛藥材OPLS-DA得分圖

F1～17-峰1～17

2.8 HPLC測定細辛中3種有效成分的含量

2.8.1 線性關系考察 精密移取“2.2.1”項下各對照品溶液適量，稀釋成一系列不同質量濃度的對照品溶液（＝6），按照“2.1”項下色譜條件進行測定，以對照品質量濃度為橫坐標（），以對照品峰面積為縱坐標（）繪制標準曲線，進行線性回歸，得到3種成分的回歸方程，結果見表3。

表3 3種成分線性關系結果

Table 3 Result of linear-regression analysis of three constituents

成分回歸方程線性范圍/(μg·mL?1)R2 甲基丁香酚Y＝5 679.4 X＋4 697.666.700～400.0000.999 8 芝麻脂素Y＝12 160 X－23 32457.000～342.0000.999 3 細辛脂素Y＝10 147 X－11 40335.700～214.0000.999 6

2.8.2 精密度試驗 取細辛藥材（S9），按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，照上述“2.1”項下色譜條件進行HPLC分析，連續進樣6次，記錄各成分峰面積，結果甲基丁香酚、芝麻脂素、細辛脂素峰面積RSD依次分別為2.14%、1.27%、1.37%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.8.3 穩定性試驗 取細辛藥材（S9），按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h后按照“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄各成分峰面積，結果甲基丁香酚、芝麻脂素、細辛脂素峰面積RSD依次分別為0.32%、0.2%、0.2%，均小于3%，表明樣品24 h內穩定。

2.8.4 重復性試驗 取細辛藥材（S9），按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，照上述“2.1”項下色譜條件進行HPLC分析，記錄色譜峰面積，測得各成分含量，結果甲基丁香酚、芝麻脂素、細辛脂素峰面積RSD依次分別為1.16%、0.59%、0.3%，均小于3%，表明此方法重復性良好。

2.8.5 加樣回收率試驗 取細辛藥材（S9），共9份，每份1 g，加入混合對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰峰面積，計算回收率。結果表明，甲基丁香酚、芝麻脂素、細辛脂素峰面積的平均回收率分別為100.18%、100.94%、101.81%，均符合《中國藥典》2015年版規定，RSD值分別為3.00%、2.21%、2.57%，結果表明方法準確可靠。

2.8.6 樣品測定 取18批細辛藥材按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算各成分含量，結果見表4。通過結果可知不同產區之間含量差異較大，遼寧產區細辛藥材中甲基丁香酚和細辛脂素的含量較高，吉林地區細辛藥材中芝麻脂素的含量較高。

3 討論

中藥藥性是中藥理論的核心，是根據中醫傳統認識，與療效有關的藥物的性質或屬性[8]。其藥材質量問題會直接影響制劑的療效和質量。《本草綱目》也記載“性從地變，質與物遷，未嘗同也。”藥材的形成受地理位置以及環境條件，例如溫度、濕度、光照、土壤等條件，繼而影響其藥物的有效物質的變化。

表4 18批細辛樣品中3個成分含量測定結果

Table 4 Content determination results of three components from 18 batches of A. heterotropoides var. mandshuricum

編號質量分數/(mg·g?1) 甲基丁香酚芝麻脂素細辛脂素 S1 9.89 1.03 2.65 S232.98 2.82 6.63 S327.54 2.71 6.66 S422.86 2.58 6.91 S5 8.17 1.92 3.87 S6 8.41 1.69 3.85 S7 7.45 1.36 2.63 S8 7.58 1.73 4.00 S9 3.70 3.92 2.74 S10 1.94 2.04 1.61 S11 7.18 5.90 4.64 S12 6.92 6.05 4.45 S13 6.71 6.01 4.87 S14 3.55 2.96 3.00 S15 3.17 3.25 4.32 S16 3.22 2.52 3.33 S17 2.46 2.29 2.93 S18 1.76 1.29 1.59

本實驗對色譜條件進行了系統考察，包括不同流動相系統（乙腈-0.05%磷酸水溶液、甲醇-0.05%磷酸和乙腈-水）、不同柱溫（25、30、35 ℃），不同體積流量（0.8、1.0和1.2 mL/min）、不同進樣量（5、10、15 μL）的考察，最終確定了北細辛分析的最佳色譜條件，通過線性關系考察、精密度、穩定性、重復性以及加樣回收率等一系列的方法學考察，可驗證該方法可行。

本研究通過收集18批不同產區的細辛藥材進行HPLC指紋圖譜研究，結果發現18批藥材相似度良好，其中共確定了17個共有峰，并指認了3個色譜峰，分別為甲基丁香酚（12號峰）、芝麻脂素（13號峰）、細辛脂素（15號峰）。從圖1指紋圖譜中可以看出遼寧產區的12號色譜峰（甲基丁香酚）峰面積大于吉林產區，而吉林產區的13號色譜峰（芝麻脂素）峰面積明顯大于遼寧產區。

通過含量測定的結果可知不同產區之間含量差異較大，遼寧產區細辛藥材中甲基丁香酚和細辛脂素的含量較高，質量分數分別為7.45～32.98、2.63～6.91 mg/g，其中遼寧新賓產區細辛藥材中的甲基丁香酚和細辛脂素質量分數最高，平均含量分別為23.32 mg/g、5.71 mg/g；吉林地區細辛藥材中芝麻脂素的含量較高，質量分數為1.29～6.05 mg/g，其中吉林通化產區細辛藥材中芝麻脂素含量最高，平均含量為4.78 mg/g。

通過運用CA和PCA對其進行綜合的質量評價，結果表明CA能將18批藥材清晰地分為2類，即遼寧產地和吉林產地，在分類距離為8時，可以將遼寧產地細分為2類，即S1～S4為遼寧新賓產區和S5～S8為遼寧鞍山產區藥材，但不能將吉林產地的藥材清晰地分離出來，可能原因是吉林靖宇和吉林通化2個產區細辛藥材的化學成分很相似，因此造成這2類數據差異性小，所以不容分開。PCA是一個無監督的學習方法，其依靠樣品間的相似性進行分析[9]。通過PCA得分圖，可以看出以軸為標準，軸上下可分為2大類，即遼寧和吉林2大產區，結果與聚類分析相同，可將遼寧產區的藥材細分為遼寧新賓和遼寧鞍山產區，但S1藥材特殊，但考慮到S1藥材與S2～S4藥材屬于同一產地，可能由個體差異所引起。

通過OPLS-DA分析結果顯示，遼寧產區和吉林產區分布距離較遠，說明遼寧產區和吉林產區樣品差異較大，并分析出了影響遼寧產區和吉林產區細辛藥材差異的8種主要成分。

綜上所述，CA、PCA、OPLS-DA是中藥指紋圖譜結合化學模式識別手段應用最普遍的分析方法，清晰地表明了不同產地細辛藥材的差異。本研究通過細辛的指紋圖譜與含量測定相結合的方法，全面反映了細辛樣品的整體質量信息，并進一步運用化學模式識別方法對其信息作進一步綜合分析，實現了對細辛的全面綜合質量評價，為多指標的復雜指紋圖譜與含量測定相結合的方法評價不同產地藥材質量提供有效的參考，也為今后其他道地藥材產地質量評價提供新思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 陸亞男, 田曉清, 周曉云, 等. 北細辛苗在不同生長階段與成熟期的主要化學成分分析 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2019, 25(9): 159-165.

[2] 中國藥典 [S]. 一部. 2015: 236.

[3] 明·李時珍. 本草綱目: 校點本 [M]. 北京: 人民衛生出版社, 1982: 164.

[4] 王志清, 宋佳, 馬海琴, 等. 不同產地細辛中主要有效成分含量測定與比較 [J]. 中草藥, 2020, 51(3): 748-756.

[5] 王志清, 鄭培和, 逄世峰, 等. 光照強度對北細辛生長發育及質量的影響 [J]. 中國中藥雜志, 2011, 36(12): 1558-1567.

[6] 曹晨, 劉震, 蘇丹, 等. 不同產地不同品種細辛藥材的無機元素分析 [J]. 中國中藥雜志, 2015, 40(8): 1535-1542.

[7] 楊冉冉, 姬蕾, 李二文, 等. 雞血藤的HPLC指紋圖譜及模式識別研究 [J]. 中草藥, 2017, 48(21): 4530-4536.

[8] 唐仕歡, 楊洪軍, 黃璐琦. 論自然環境因子變化對中藥藥性形成的影響 [J]. 中國中藥雜志, 2010, 35(1): 126-128.

[9] 李士敏, 李強, 孫崇魯, 等. 基于多模式識別結合指紋圖譜的三葉青產地鑒別比較研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(1): 197-203.

Quality assessment ofvar.based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint

LI Yan, HE Wen-yuan, WANG Kang-yu, BAI Yu-xin, GAO Wen-yi, GONG Ji-yu

College of Pharmacy, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China

To analyze the quality ofvar.from different areas by multiple chemical pattern recognition based on HPLC fingerprint and multi-component content, so as to provide a reference for the quality evaluation ofvar..A total of 18 batches ofvar.samples from four producing areas were collected, HPLC fingerprints were collected and the content of three active ingredients was determined. The quality ofvar.in different areas was explored through CA, PCA and OPLS-DA methods.The fingerprint ofvar.was established, and three common peaks were identified. The mass fractions of methyl eugenol, sesamin and asarinin were 1.76—32.98, 1.03—6.05 and 1.59—6.91 mg/g, respectively. CA method could group the four origins ofvar.medicinal materials into two categories. PCA results extracted two principal components. The medicinal materials of the two major producing areas were clearly distinguished by OPLS-DA.The multi-pattern recognition method based on the establishment of the HPLC fingerprint and the determination of the content comprehensively evaluates the quality ofvar.. It provides a basis for the quality evaluation of medicinal materials and can be used as an effective method for quality control ofvar..

Fr. Schmidt var.(Maxim.) Kitag.; HPLC; fingerprint; chemical pattern recognition; quality assessment; methyl eugenol; sesamin; asarinin

R286.2

A

0253 - 2670(2022)01 - 0238 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.027

2021-06-06

國家中藥標準化項目（ZYBZH-Y-JL-25）；古代經典名方顆粒劑的開發研究（SW-KF105）；吉林省科技發展計劃項目（20170204028YY）

李 妍（1997—），女，碩士研究生，從事中藥分析學研究。E-mail: liyan1234512345@163.com

高文義，教授，博士生導師，主要從事中藥分析學研究。E-mail: 565882264@qq.com

貢濟宇，教授，博士生導師，主要從事中藥分析學研究。E-mail: gjy0431@126.com

[責任編輯 時圣明]