逆境脅迫下紅花CYP450s基因的表達與幼葉總黃酮含量的相關性分析

孫國慶，劉建雨，吳發明，張慶宇，馬鑫彤，張馨月，洪瑛琪，姚 娜，楊建文*，劉秀明*

逆境脅迫下紅花基因的表達與幼葉總黃酮含量的相關性分析

孫國慶1，劉建雨2#，吳發明1，張慶宇2，馬鑫彤2，張馨月2，洪瑛琪2，姚 娜2，楊建文1*，劉秀明2*

1. 遵義醫科大學，貴州 遵義 563000 2. 吉林農業大學生命科學學院，生物反應器與藥物開發教育部工程研究中心，吉林 長春 130118

克隆細胞色素P450s（CYP450s）家族成員的2個基因，探究紅花幼葉在逆境脅迫下基因的表達與紅花總黃酮含量變化關系。以吉紅1號為材料，對家族的2個基因、進行基因克隆表達及分析。研究了茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、干旱（PEG-6000）、光及暗處理4種逆境脅迫對紅花總黃酮含量的影響，分析了和基因的表達與葉片總黃酮含量之間的相關性。編碼區序列為1014 bp，編碼337個氨基酸；編碼區序列為1287 bp，編碼428個氨基酸。2個基因在不同脅迫條件下的表達量及總黃酮含量的變化表明：MeJA處理后，與野生型相比，葉片中的總黃酮含量均有不同程度的增加。、的表達量與總黃酮的積累量呈正相關；當采用PEG-6000處理后，處于正調控，而處于負調控狀態，紅花的葉片中總黃酮含量均顯著增加；光脅迫下，在一定時間內總黃酮含量與基因表達量呈正相關，與基因表達量呈負相關，暗脅迫下總黃酮含量與及基因表達趨勢一致都在一定時間內呈正相關。成功克隆了紅花及基因。qRT-PCR分析表明，、基因可能在紅花幼葉期對逆境脅迫的適應中發揮重要作用，為紅花家族基因在紅花黃酮代謝合成的功能研究提供理論依據。

紅花；基因；黃酮；逆境脅迫；基因表達；茉莉酸甲酯

紅花L.，別名紅藍花、刺紅花，為菊科、紅花屬植物，干燥的管狀花，橙紅色，花管狹細，具有特異的香味，主產于河南、湖南、四川、新疆、西藏等地。紅花作為一種重要的藥用植物，喜溫暖、干燥的氣候，抗寒性強，耐貧瘠，是我國傳統的中草藥，有活血化瘀、散濕去腫的功效[1]。紅花中的黃酮屬于低分子的天然植物成分，是一種酚類物質，又被稱為生物黃酮或植物黃酮，屬于植物次級代謝產物[2]，它廣泛存在于各種各樣的植物和大型真菌中，到目前為止，已經有數百種不同類型的黃酮類化合物在植物中被發現，人工合成的黃酮類化合物也不斷問世[3]。紅花黃酮類化合物的藥理作用非常廣泛，其中包括抗氧化、抗炎、舒張血管、抑制血小板聚集和調節血脂等作用。研究表明類黃酮中的羥基紅花黃A是紅花黃酮類化合物的主要活性元素，具有抗氧化及心肌保護作用[4]，近年來黃酮類化合物在心血管保護方面主要具有減少氧化應激、減少炎癥信號分子表達、擴張血管及降壓作用、抑制血小板聚集、影響脂質代謝5個方面的重要作用[5]。此外，研究發現黃酮類化合物的合成與積累量取決于其合成途徑中的關鍵酶[6]，它們在植物次生代謝物合成途徑中往往位于代謝支路分叉口或次生代謝物合成途徑的下游，能進一步決定代謝的流向[7-8]。紅花在生長發育過程中，還會受到自然界各種逆境脅迫的影響，如強光、干旱、黑暗等，由于黃酮是一類重要的次生代謝產物，其合成、積累與植株的生長環境密切相關并參與植物的抗逆過程，是植物抵抗外界不利環境的重要保護物質。目前，國內外對黃酮類化合物的研究在提取、測定方面已有較多報道，但關于紅花中不同脅迫條件下的黃酮含量變化與關鍵酶基因表達間的關系研究較少。

細胞色素P450s（CYP450s）是一類超基因家族編碼的單加氧酶，主要存在于動植物體內及微生物體內，在生物防御方面具有重要作用[9]。研究報道，CYP450s是高等植物中最大的酶蛋白家族，催化內源性物質如脂類、黃酮類、萜類、生物堿類等的生物合成代謝[10-11]。因其多種生物學功能被人們稱為萬能的生物催化劑[12]。CYP亞家族成員在植物花瓣中能夠催化w末端的連續氧化反應，從而影響其次生代謝產物的合成及信號傳導，在調控植物生長發育及次生代謝方面起著重要作用[13-15]。數據表明，類黃酮的生物合成是通過多酶復合物進行的，其中CYP450s家族是重要組成部分，但與類黃酮生物合成相關的基因的調控機制尚不明確[16]。

CYP71A與CYP81E同屬于CYP450s家族的不同亞家族，兩者都為細胞色素單加氧酶，苜蓿中有表征過亞家族3位成員、和，以異黃酮為底物，影響類黃酮類化合物生物素的含量變化[17]；在功能上，催化氨基酸生成的次生代謝產物，與植物的防御和抗逆境脅迫相關[18]。

為探究紅花幼苗期總黃酮含量變化情況及逆境脅迫下的應答反應機制，本研究以吉紅一號為材料，研究茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、干旱[聚乙二醇6000（PEG6000）]、光照和黑暗4種非生物逆境脅迫處理對紅花幼葉中總黃酮含量的影響，同時利用qRT-PCR技術，分析黃酮合成途徑中與基因在逆境脅迫下的表達量變化，從分子水平上探討總黃酮含量與家族基因表達的相關性，為與基因在紅花黃酮代謝調控中的研究奠定基礎。

1 材料與試劑

1.1 材料

樣品經吉林農業大學劉秀明高級實驗師鑒定為紅花L.品種吉紅1號，于吉林農業大學生物反應器與藥物開發教育部工程中心人工氣候室種植。

1.2 主要試劑

對照品蘆丁（批號SR8250，質量分數98%）購自北京索萊寶科技有限公司，RNAiso PLUS試劑、反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自寶日醫生物技術（北京）有限公司。PEG6000、MeJA購自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法

2.1 紅花的栽培、處理及樣品采集

供試材料吉紅1號種植于吉林農業大學生物反應器與藥物開發教育部工程研究中心。選取葉幼嫩時期（種子萌發后約20 d）長勢一致的植株，分別用300 μmol/L MeJA溶液、20% PEG6000溶液、光處理（800 μmol/(m2·s)，光照時長12～60 h）、暗處理（暗培養時長12～60 h），對照組[光強度為600 μmol/(m2·s)]為正常培養。采集脅迫處理條件下的葉片各6份，3份置于60 ℃恒溫箱烘干至恒定質量，用于提取總黃酮，另3份迅速裝入采集袋，用錫箔紙包裝后凍存于?80 ℃，用于提取RNA。采集野生型紅花的4個時期（花蕾期、初花期、盛花期、衰落期）花瓣，錫箔紙包好，經液氮處理后保存于?80 ℃冰箱備用。

2.2 RNA提取及反轉錄cDNA

利用RNAiso PLUS試劑提取紅花4個花期花瓣總RNA，然后通過反轉錄試劑盒將驗證后未降解且濃度適宜的RNA反轉錄成cDNA，反轉錄成功的cDNA用于后續的基因克隆及表達分析。并保存于?20 ℃備用。

2.3 CtCYP81E和CtCYP71A亞家族基因的表達分析

根據紅花基因組測序結果，注釋到紅花家族中的2個亞家族成員和，亞家族包含15個基因，分別命名為～，亞家族包含19個基因，分別命名為～，通過qRT-PCR分析基因的表達情況。利用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）試劑盒，使用Mx3000P TM Real Time PCR儀，操作系統為Stratagen（Mx3000P）檢測基因表達量的變化。2步法PCR擴增標準程序為95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；40個循環；熔解曲線為95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，30 s。熒光定量PCR反應結束后，收集樣品內參基因和和基因亞家族的t值，采用2?ΔΔCt法，基因亞家族以紅花的花蕾期作為基數1進行表達差異的數據分析，基因亞家族以紅花的初花期作為基數1進行表達差異的數據分析。

2.4 CtCYP81E8和CtCYP71A1基因的克隆

通過與紅花黃色素積累量進行比較，發現亞家族第8條基因、CtCYP71A亞家族第1條基因的表達量在盛花期最高，且與紅花黃色素積累量趨勢一致，因此將其命名為CtCYP81E8、CtCYP71A1并做后續的基因克隆，設計CtCYP81E8特異性引物進行基因克隆。上游引物為CtCYP81E8f：5’-ATGATGAGGATGATTAGTGG-3’，下游引物為CtCYP81E8r：5’-TCAAAGATG- CGATAAT AGATTT-3’，設計CtCYP71A1特異性引物進行基因克隆，上游引物為CtCYP71A1f：5’-AATAGGATCCATGCTCATTCACTTTGGTAGT-TT-3’，下游引物為CtCYP71A1r：5’-AATAG- AATTCTCACCGAGCACTTAACTTGAC-3’；以紅花盛花期花瓣cDNA為模板進行編碼區序列的擴增，設計55～65 ℃退火溫度梯度，CtCYP81E8擴增體系最適合的退火溫度為58 ℃，CtCYP71A1擴增體系最適合的退火溫度為62 ℃，PCR程序設置為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸 90 s，72 ℃后延伸8 min，30個循環。PCR產物膠回收后連接pEASY-T1克隆載體進行測序。

2.5 CtCYP81E8和CtCYP71A1對MeJA、PEG-6000干旱、光及暗脅迫的響應

配制MeJA原濃度為300 mmol/L，稀釋1000倍成終濃度為300 μmol/L，將其噴灑在3周齡紅花幼葉上，采樣時間設置為2、4、6、8、12 h；配制20% PEG6000，澆灌在盆缽中，采樣時間為12～72 h，每12小時為一時間梯度；將暗處理一組放置在暗箱內避光處理，光及暗脅迫采樣時間為12～60 h，待脅迫完成后剪取新鮮樣品凍存于?80 ℃，利用RNAiso PLUS試劑提取紅花幼葉在4種脅迫條件下的RNA，通過反轉錄試劑盒將驗證后未降解且濃度適宜的RNA反轉錄成cDNA，反轉錄成功的cDNA用于qRT-PCR分析和基因表達量的變化。

2.6 不同脅迫條件下紅花總黃酮的提取和測定

提取不同脅迫條件下幼葉的總黃酮，65 ℃烘箱烘干，研磨成粉末過40目篩，稱取0.5 g粉狀物，加入65%乙醇10 mL，超聲波（600 W，50 ℃）50 min后離心。吸取上清液，每個樣品3次重復，利用選定的最佳吸收峰波長，進行吸光度的測定。并基于AlCl3比色法制備蘆丁標準曲線。準確稱取0.010 0 g蘆丁對照品，加入30%的乙醇溶液，充分溶解后，定容至100 mL，即為蘆丁對照品溶液，質量濃度為0.1 mg/mL。在5個10 mL量瓶中，將蘆丁對照品溶液分別準確吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別加入30%的乙醇，將各溶液體積補充至5 mL，再加入0.3 mL濃度為5%的亞硝酸鈉溶液，充分混勻，靜置5 min，加入0.3 mL濃度為10%硝酸鋁溶液，充分混勻，靜置5 min，加入4 mL濃度為4%的氫氧化鈉溶液，充分混勻，加入30%的乙醇定容，充分混勻，靜置10 min。將靜置后的溶液置于340 nm的波長下掃描。繪制標準曲線并進行樣品測定。總黃酮含量以蘆丁當量計算，以蘆丁量為橫坐標（），吸光度值為縱坐標（），蘆丁的線性關系為＝8.7＋0.177 1，2＝0.997 5。

3 結果與分析

3.1 RNA提取及反轉錄cDNA

紅花花瓣RNA提取如圖1所示。通過Nanodrop檢測發現，提取的RNA質量濃度在1000 ng/μL左右。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量，由圖1可以看到28、18、5 S 3條清晰帶，說明RNA提取質量較好，無降解現象，可以滿足后續實驗需要。

3.2 CYP81E、CYP71A亞家族基因的相對表達量分析

采用2?ΔΔCt法，對紅花花蕾期、初花期、盛花期、衰落期4個不同發育時期進行表達差異的數據分析，并對亞家族的15條基因（圖2-A）及亞家族的19條基因（圖2-B）做柱形圖分析，通過與紅花黃色素積累量進行比較，發現基因的表達與紅花黃色素積累量變化趨勢一致（圖2-C），而在盛花期表達量最高（圖2-D）因此選擇、基因做后續克隆及功能鑒定。

圖1 紅花花瓣總RNA提取電泳圖

3.3 CtCYP81E8和CtCYP71A1基因的克隆

以紅花盛花期花瓣cDNA為模板，使用高保真酶進行梯度PCR，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果基因在1014 bp位置擴增出目的片段（圖3-A），因58 ℃時未出現引物二聚體，將最終的退火溫度定為58 ℃；而基因在1287 bp位置擴增出目的片段（圖3-B），最終退火溫度為62 ℃，將帶有目的基因的PCR產物連接到pEASY-T1克隆載體上，并轉化大腸桿菌感受態，挑取單克隆后進行菌液PCR電泳及雙酶切驗證，將鑒定正確的菌液送去測序，測序結果與原序列吻合，說明及構建成功。

圖2 CYP81E(A, C)、CYP71A (B, D) 亞家族基因的表達分析

M-Marker 1～6-PCR退火溫度為55～60 ℃ 7～16-PCR退火溫度為55～64 ℃

3.4 CtCYP81E8對MeJA、PEG6000干旱、光脅迫及暗脅迫的響應

利用qRT-PCR對MeJA脅迫條件下的基因表達量進行分析，結果顯示(圖4-A)與對照組（0 h）相比，基因的表達呈現上升趨勢，其中2～8 h呈明顯上升趨勢，在8 h時，基因的表達量達到最大，12 h時，表達量顯著降低；PEG6000干旱脅迫條件下，基因的表達與對照組存在顯著差異，在整個脅迫過程中始終保持高表達狀態(圖4-C)，且該基因在脅迫處理24 h后基因表達量最高，說明該基因有可能為響應PEG6000干旱脅迫的基因；在強光照射條件下，處理12～60 h的基因表達水平相較于野生型均有所下調，且在36 h下調最為顯著(圖4-B)；暗處理后的該基因表達水平相對于光照處理反而在36 h表達量達到最大，12～36 h表達量均為上升狀態，36 h后突然急劇下降，但整體表達水平相較于野生型均有所上調(圖4-D)。

對照組（0 h）比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下同

3.5 CtCYP71A1對MeJA、PEG6000干旱、光及暗脅迫的響應

MeJA脅迫處理2～12 h后，與對照組相比，基因在4 h時表達量達到最大，2～4 h時表達量隨之增加，自6 h之后基因表達水平與野生型相比呈持平狀態，整體表達水平呈先升高，后降低的趨勢（圖5-A）；20% PEG6000脅迫處理后，該基因表達水平均呈下降趨勢，且在24 h表達量達到最低（圖5-C）；在光（圖5-B）及暗（圖5-D）脅迫條件下，該基因的表達量趨于一致，均在36 h表達量最高，且都高于對照組，并且12、24、48、60 h相較于野生型變化趨勢均不明顯。

圖5 MeJA (A)、光 (B)、PEG-6000 干旱(C) 及暗 (D) 脅迫下CtCYP81E8基因的表達分析

3.6 逆境脅迫對紅花幼葉期總黃酮含量的影響

圖6表明，幼葉期紅花總黃酮在MeJA脅迫處理2～12 h后，隨著脅迫時間的加長，總黃酮含量逐漸增加，在8 h時達到最大。與對照相比差異顯著；葉中總黃酮含量在12 h下降，但仍高于野生型。這與基因的表達水平趨于一致，說明該基因可能參與調控黃酮類化合物的合成；PEG-6000干旱脅迫處理12～60 h后，葉中總黃酮含量在12～24 h與其他時期相比達到極顯著差異，總黃酮含量與基因表達量呈正相關，與基因表達量呈負相關；光處理12～60 h后，總黃酮含量相較于野生型呈正調控與基因表達量呈正相關，與基因表達量呈負相關；暗處理條件12～48 h條件下，總黃酮含量與及基因表達趨勢一致，與對照組相比，皆呈上升趨勢，及基因均在處理36 h時表達量最高。

圖6 逆境脅迫對紅花幼葉期總黃酮含量的影響

4 討論

植物在極端溫度和干旱等逆境脅迫下，主要通過影響細胞的膜結構從而產生氧化脅迫[19]，由于黃酮本身具有很強的抗氧化作用，因此黃酮在植物組織中的積累可以增強其對于非生物脅迫的耐受性。Kirakosyan等[20]通過對山楂樹進行冷處理及干旱處理后，發現處理后葉片中的金絲桃苷中黃酮含量顯著提升。Li等[21]研究表明，黃酮能提高植物的耐受性，降低紫外輻射對細胞的損傷。董新純等[22]通過UV-B脅迫苦蕎實驗，發現葉片類黃酮含量提高，但高幅照度和長時間UV-B處理則使后期類黃酮含量下降，說明黃酮類化合物在植物對逆境脅迫的應答中具有重要作用。

本研究中黃酮可能以不同的抗逆機制參與4種脅迫，從而引起其含量在脅迫過程中出現不同的變化趨勢，家族中的2個基因在逆境脅迫下均有所表達且表達模式存在較大差異。紅花幼葉在茉莉酸甲酯脅迫下，在8 h葉中總黃酮含量達到最高值，與對照組相比差異顯著，葉中總黃酮含量在12 h下降，基因與基因的表達趨勢為先升高，后降低，此現象可能與外界刺激誘導黃酮合成中間產物并與合成花青素等色素有關[23]。在PEG-6000干旱脅迫下，紅花幼葉中基因表達量的變化相較其他脅迫有明顯變化趨勢。PEG-6000干旱脅迫可誘導黃酮的合成與積累，葉中總黃酮含量在12～24 h與其他時期相比達到極顯著差異，其原因可能是嫩葉期，紅花的葉向根或莖中輸送黃酮類化合物合成前體，且輸送通道中存在的相關氧化酶催化黃酮合成，從而引起葉中總黃酮含量的顯著變化[24-27]。總黃酮含量在24 h達最大，隨著干旱脅迫時間的延長，而后略有降低，這與基因的表達趨勢一致，表明長期干旱脅迫下植物體內的活性氧動態平衡受到破壞，抗氧化酶活性呈現先升高后降低的趨勢[28]，與基因的表達呈負相關，原因可能是隨著黃酮的合成，大量的產物對酶產生了一定的反饋抑制從而引起相關性降低[29]。王強[30]關于瀕危植物長葉榧光合生理生態特性及次生代謝產物研究表明，采用光處理后的長葉榧不同營養器官黃酮類化合物在不同時期存在顯著差異。在光處理24～48 h時，葉片的總黃酮含量相比于野生型含量略有提升，基因的熒光定量結果顯示24 h高表達，基因的熒光定量結果顯示36 h高表達，說明2條氧化酶基因在植物抵抗光輻射過程中，可能參與黃酮類化合物的合成。王龍飛[31]在研究胡枝子花青素中發現，光輻射脅迫下，花青素大量積累，且脅迫時間越長脅迫強度越大，花青素含量越高，說明光輻射下部分黃酮合成前體物可能被誘導用于花青素支路代謝。暗處理12～48 h下，總黃酮含量與及基因表達趨勢一致，與野生型相比，皆呈上升趨勢，及基因表達量在脅迫36 h時達到最高，總黃酮含量在暗處理下差異不明顯，在12 h略高于其他時期，可能是由于暗處理下，及基因的活性在黃酮類物質代謝中未有明顯提高[32-35]。

植物黃酮合成途徑由多條代謝支路交錯連接而成，包含多個酶基因，這些酶基因的表達高度依賴于組織類型和對內部或外部信號的響應[36]。朱東春[37]研究發現，鬼針草酶活性對總黃酮具有影響。本研究發現，4種脅迫處理后及基因表達量的增加與黃酮含量升高在一定時間段呈正相關，二者積極響應脅迫刺激。逆境脅迫下這2個基因與黃酮含量均顯示不同的變化趨勢，表明在紅花幼葉期紅花黃酮含量的變化與基因表達水平有著直接關系[38]。

本研究成功克隆了紅花家族中的2個亞家族基因及，分析其在逆境脅迫下的表達與紅花幼葉總黃酮含量的相關性。結果表明，及基因在不同脅迫處理下的表達與總黃酮含量均呈現一定的正相關或負相關，推測及基因可能在紅花的葉期響應4種逆境脅迫，參與紅花黃酮化合物的生物合成。該研究一方面為研究紅花應對環境脅迫的生理機制提供理論依據，另一方面為研究及基因的功能鑒定奠定基礎，為深入研究家族基因在紅花黃酮代謝調控中的作用機制提供理論依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Correlation analysis between expression ofgene inand total flavonoids content in young leaves under stress

SUN Guo-qing1, LIU Jian-yu2, WU Fa-ming1, ZHANG Qing-yu1, MA Xin-tong2, ZHANG Xin-yue2, HONG Ying-qi2, YAO Na2, YANG Jian-wen1, LIU Xiu-ming2

1. Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China 2. Engineering Research Center for Bioreactor and Drug Development, Ministry of Education, College of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China

Two genes of members of thefamily were cloned to explore the relationship between the expression ofgenes and the changes in total flavonoids in young leaves of Honghuaunder stress.Using Jihong No. 1 as the material, the two genesandof thefamily were cloned, expressed and analyzed. The effects of methyl jasmonate, drought (PEG-6000), light and dark treatments on the content of total flavonoids inwere studied, and the correlation between the expression ofandgenes and the content of total flavonoids in leaves was analyzed.Thecoding region sequence was 1014 bp, encoding 337 amino acids; thecoding region sequence was 1287 bp, encoding 428 amino acids. The expression of the two genes under different stress conditions and the changes in total flavonoid content indicated that the total flavonoid content in the leaves increased to varying degrees after treatment with methyl jasmonate compared with the wild type. The expression ofandwas positively correlated with the accumulation of total flavonoids; when treated with PEG-6000,was under positive regulation, whilewas under negative regulation, and the total flavonoid content in the leaves ofincreased significantly; Under light stress, the total flavonoid content was positively correlated withgene expression in a certain period of time, and negatively correlated withgene expression. Under dark stress, the total flavonoid content was consistent withandgene expression trends, and both showed a positive correlation within a certain period of time.Theandgenes ofwere successfully cloned. qRT-PCR analysis showed thatandgenes may play an important role in the adaptation ofyoung leaves to adversity stress. This study provides a theoretical basis for the study offamily genes in flavonoid metabolism and synthesis of.

L.;gene; flavonoids; adversity stress; gene expression; methyl jasmonate

R282.12

A

0253 - 2670(2022)01 - 0222 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.025

2021-07-06

國家自然科學基金資助項目（31771868）；國家自然科學基金資助項目（81760679）；吉林省科技廳項目（20190201172JC）；吉林省科技廳項目（20190201175JC）；吉林農業大學大學生創新創業訓練計劃項目；貴州省中醫藥管理局項目

孫國慶（1996—），女，碩士研究生，主要從事醫院藥學研究。E-mail: 747167737@qq.com

劉秀明（1981—），女，高級實驗師，從事生物反應器與代謝調控研究。E-mail: xiuming1211@163.com

楊建文（1968—），男，主任藥師，從事醫院藥學研究。E-mail: yjw67315@163.com

#共同第一作者：劉建雨（1996—），女，碩士研究生，主要從事植物次生代謝調控研究。E-mail: 2524465081@qq.com

[責任編輯 時圣明]