黃芩湯對非酒精性脂肪肝大鼠腸道菌群的影響

嚴寶飛，袁 鵬，劉圣金，劉 嘉，段金廒，毛藝蓓，凌旭恒

黃芩湯對非酒精性脂肪肝大鼠腸道菌群的影響

嚴寶飛1, 2，袁 鵬2，劉圣金2，劉 嘉1*，段金廒2，毛藝蓓1，凌旭恒1

1. 江蘇衛生健康職業學院，江蘇 南京 211800 2. 南京中醫藥大學 江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心/中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心/國家中醫藥管理局中藥資源循環利用重點研究室，江蘇 南京 210023

研究黃芩湯對非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）大鼠腸道菌群的影響。將大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥（多烯磷脂膽堿，8 mg/kg）組及黃芩湯低、高劑量（5、20 g/kg）組，采用高脂飲食飼喂9周造模。ig給藥5周后，采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血脂和肝功能相關指標；采用HE染色法分析各組大鼠肝臟組織病理變化；采用16S rRNA測序技術分析各組大鼠腸道菌群變化。與模型組比較，黃芩湯低、高劑量組大鼠體質量明顯降低（＜0.05、0.01），血脂指標總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和轉氨酶指標丙氨酸氨基轉移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate transaminase，AST）明顯降低（＜0.01），血脂指標高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoproteincholesterol，HDL-C）明顯升高（＜0.01），肝細胞脂肪變性與氣球樣變得到糾正，炎細胞浸潤減少。16S rRNA測序結果顯示，模型組大鼠腸道菌群較空白組發生變化；黃芩湯低、高劑量組大鼠腸道菌群較模型組sobs、heip和Shannon指數明顯提升（＜0.05、0.01）；在門和屬水平上，黃芩湯高劑量組大鼠腸道菌群較模型組unclassified-f-Lachnospiraceae、布勞特氏菌屬、group和瘤胃球菌屬豐度明顯升高（＜0.05、0.01），放線菌門（Actinobacteria）、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬豐度明顯降低（＜0.05、0.01）。黃芩湯高劑量組較模型組明顯上調京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和直系同源簇（clusters of orthologous groups，COG）富集的功能水平（＜0.05、0.01）。黃芩湯可能通過改善NAFLD大鼠腸道菌群失調發揮對NAFLD的治療作用。

黃芩湯；非酒精性脂肪肝；16S rRNA；腸道菌群；黃芩苷；漢黃芩苷；黃芩素；漢黃芩素；芍藥苷；甘草苷；甘草酸

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是全球范圍內最常見的慢性肝病，其通常被認為是代謝綜合征的肝臟表現，與諸多代謝性疾病的危險因素如肥胖、血脂異常、高血壓和2型糖尿病等密切相關[1]。隨著各類代謝綜合征的全球化，NAFLD的患病率也隨之升高，已達25%左右[2]。除可直接進展為肝炎、肝硬化和肝細胞癌，NAFLD亦與心血管疾病及慢性腎臟疾病的高發病率有關[3-4]。為此，NAFLD已嚴重威脅人類健康。肝臟和腸道通過膽道、門靜脈和體循環廣泛聯系形成“肝-腸軸”，肝臟可以受來自腸道菌群及其代謝產物、環境毒素和食物抗原等多種信號的調控[5]。長期研究表明，腸道菌群能夠在調節宿主免疫與內分泌功能、傳遞神經信號及藥物作用和代謝等諸多方面發揮重要作用。健康的腸道菌群有助于調節人類宿主的代謝尤其是肝臟等重要代謝器官的功能[6]。當腸道菌群異常時，則可能導致機體免疫狀態改變和促進NAFLD等各種肝臟疾病的發生發展[7]。因此，腸道菌群可能成為NAFLD的潛在治療靶點。

黃芩湯為我國療效確切的經方之一，最早出自張仲景的《傷寒論》，在中醫臨床應用中已有1800余年，有“萬世治痢之祖劑”“溫病第一湯”之美稱[8]。該方由黃芩、白芍、炙甘草和大棗組成，4藥合用共奏清熱治利、和中止痛之功效，治煩熱下利、腹攣痛而急迫者[9]。黃芩湯及其藥味組成中含有豐富的黃酮類、三萜類及單萜類等藥效物質，可通過多種途徑，作用于多種靶點，具有保肝、調脂、降糖、抗炎、免疫調節、抗氧化等功效[10]。諸多證據顯示，黃芩湯及其藥味組成對于2型糖尿病等代謝性疾病，肝癌、肝損傷等肝臟疾病和炎性腸道疾病具有良好的治療效果，但目前尚無關于黃芩湯對NAFLD治療作用的直接報道[8,11-12]。基于此，本研究首次以NAFLD大鼠模型為研究對象，研究黃芩湯對NAFLD的治療作用，并基于腸道菌群角度初步探討其治療機制，以期為黃芩湯治療NAFLD提供有益思路。

1 材料

1.1 動物

33只SPF級SD雄性大鼠由杭州醫學院提供，體質量（220±20）g，生產許可證號SCXK（浙）2019-0002。本次動物實驗經江蘇衛生健康職業學院 [實驗動物使用許可證編號為SYXK（蘇）2020-0001] 實驗動物倫理委員會批準（批準編號JHVC-IACUC-2021-B003），符合實驗動物福利與倫理原則。

1.2 藥物及試劑

黃芩（批號20210322）、白芍（批號20210106）、炙甘草（批號20210116）和大棗（批號20210223）飲片均購自江蘇省中醫院，經南京中醫藥大學段金廒教授鑒定為正品，符合《中國藥典》2020年版標準，憑證標本存放在江蘇衛生健康職業學院中心實驗室。多烯磷脂膽堿（批號210315）購自Sanofi（北京）公司；4%多聚甲醛（批號BL539A）購自Biosharp公司；蘇木素-伊紅（HE，批號BP-DL001）購自南京森貝伽生物公司；普通飼料、高脂飼料（88%普通飼料、2%膽固醇、10%豬油），均購自江蘇協同醫藥生物公司；E.Z.N.A.?DNA抽提、AxyPrep DNA凝膠回收、NEXTFLEX?DNA快速測序試劑盒，均由上海美吉生物公司提供。

1.3 儀器與設備

Multiskan MK3型酶聯免疫檢測儀，美國Thermo公司；Hitachi7170A型全自動生化分析儀，日本日立公司；BX53型生物顯微鏡，日本Olympus公司；RM2235型病理切片機，德國Leica公司；DYY-6C型核酸電泳儀、ND2000型光度計、9700型PCR儀、Quantus?型高靈敏熒光計、Miseq PE300測序平臺，均由美吉生物公司提供。

2 方法

2.1 黃芩湯制備

黃芩湯由黃芩、白芍、炙甘草和大棗按3∶2∶2∶2配伍組成，稱取藥材后加入10倍體積水浸潤1 h后煎煮，煎煮1 h濾過，隨后濾渣加入8倍體積水繼續煎煮1 h，合并2次濾液并濃縮[13]，最后得到生藥量為1.0 g/mL黃芩湯藥液，保存于4 ℃環境中備用。采用液相色譜質譜聯用法（UPLC-TQ-MS）對上述黃芩湯藥液中主要成分進行定量分析，結果顯示其中主要成分黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、芍藥苷、甘草苷、甘草酸質量分數分別為5.07%、0.55%、0.77%、0.08%、0.81%、0.04%、0.21%。

2.2 大鼠NAFLD模型的建立及分組

33只SD雄性大鼠適應性飼養7 d后，隨機分為空白組（6只）和高脂飲食組（27只）。空白組以普通飼料喂養，高脂飲食組以高脂飼料飼喂9周造模。9周后隨機處死3只高脂飲食組大鼠取肝臟進行病理學檢查，確認NAFLD是否造模成功，將余下24只按每組6只隨機分為模型組（生理鹽水）、陽性藥組（多烯磷脂膽堿）組、黃芩湯低劑量和高劑量組。每天ig給藥1次，其中空白組和模型組給予等量生理鹽水，陽性藥組給予多烯磷脂膽堿8 mg/kg，黃芩湯低、高劑量組給予黃芩湯藥液5、20 g/kg[14]。給藥5周，每周稱體質量1次。

2.3 動物處死與取材

末次給藥后禁食12 h采用二氧化碳吸入法處死，處死方法符合實驗動物福利倫理要求，具體方法：將大鼠至于安樂死箱內，充入100%二氧化碳，二氧化碳置換率為每分鐘10%～30%箱內體積；隨后抗凝管采集血液，液氮速凍結腸內容物，4%多聚甲醛固定保留肝臟組織。

2.4 肝組織病理學檢查

取固定后各組大鼠肝臟使用梯度濃度乙醇及二甲苯脫水，石蠟包埋，儲存備用。將肝組織蠟塊切片并脫蠟，根據說明書進行HE染色，隨后置于顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 生化指標檢測

將各組大鼠抗凝全血分離血漿（3000 r /min），采用全自動生化分析儀檢測肝功能指標丙氨酸氨基轉移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate transaminase，AST）和血脂指標總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoproteincholesterol，HDL-C）水平。

2.6 結腸內容物DNA抽提和PCR擴增

按照DNA抽提試劑盒說明書抽提各組大鼠結腸內容物腸道菌群總DNA并檢測其提取質量（凝膠電泳），隨后對DNA進行定量（紫外分光光度法）。基于338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）- 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對16S rRNA基因V3～V4可變區進行PCR擴增，擴增程序：95 ℃預變性3 min，27個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃穩定延伸10 min，最后在4 ℃進行保存；反應體系：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補足至20 μL，每個樣本3個重復[15]。

2.7 結腸內容物Illumina Miseq測序

按照DNA凝膠回收試劑盒說明書純化回收的PCR產物并檢測（凝膠電泳），隨后對回收產物進行定量（熒光法）。按照DNA快速測序試劑盒說明書進行建庫，基于Illumina Miseq PE300平臺進行測序，得到原始測序序列。將上述序列導入Trimmomatic質控以及Flash軟件（v1.2.11）拼接，實現序列優化，質控及拼接參數與文獻報道一致[15]。

2.8 數據處理與分析

基于97%相似度，運用美吉生物生信云（https:// cloud.majorbio.com/）將處理后的序列歸為多個無嵌合體操作分類單元（operational taxonomic unit，OUT）；利用美吉生信云Uparse軟件（v7.0.1090）進行OUT分析、Pan/Core物種分析、Alpha多樣性分析、稀釋曲線分析和Rank-Abundance曲線分析；利用美吉生信云tax_summary_a文件夾中的數據表進行群落組成分析；利用美吉生信云Qiime軟件（v1.9.1）和R軟件（v3.3.1）進行主成分分析（principal component analysis，PCA）；利用美吉生信云R軟件（v3.3.1）和Python軟件（v3.9）進行組間差異顯著性檢驗；利用美吉生信云進行線性判別分析效應大小（linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）多級物種差異判別分析；利用美吉生信云R軟件（v3.3.1）進行Pearson相關系數分析；利用美吉生信云PICRUSt軟件（v1.1.0）進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和直系同源簇（clusters of orthologous groups，COG）功能富集分析。

（1）固定資產投資。本工程建設期為1年，正常運行期30年，社會折現率8%。其固定資產總投資2504.78萬元。根據規定，需對工程投資概算進行調整，主要剔除屬于國民經濟內部轉移支付的計劃利潤、三稅稅金和設備儲備貸款利息等，調整后的總投資為2253萬元。

3 結果

3.1 大鼠體質量的變化

如圖1所示，給藥前，模型組、陽性藥組、黃芩湯低劑量和高劑量組大鼠體質量差異不大，但與空白組有明顯差異（＜0.01）。給藥后，每組大鼠體質量均有增長，相較于模型組，陽性藥（多烯磷脂膽堿）組、黃芩湯低劑量和高劑量組大鼠體質量增長不明顯（＜0.05、0.01），說明多烯磷脂膽堿和黃芩湯具有控制NAFLD大鼠體質量增長的作用。

3.2 大鼠血脂和轉氨酶指標變化情況

如圖2所示，相較于空白組，模型組大鼠血脂指標TC、TG、LDL-C和轉氨酶指標ALT、AST明顯升高（＜0.01），血脂指標HDL-C明顯降低（＜0.01），說明大鼠NAFLD模型建立成功。相較于模型組，陽性藥組、黃芩湯低劑量和高劑量組大鼠血脂指標TC、TG、LDL-C和轉氨酶指標ALT、AST明顯降低（＜0.01），血脂指標HDL-C明顯升高（＜0.01），說明多烯磷脂膽堿和黃芩湯對NAFLD大鼠都具有調脂和保肝作用。

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與陽性藥組比較：@P＜0.05

3.3 大鼠肝臟組織病理學分析

如圖3所示，空白組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞形態正常，大小均一，呈放射狀排列整齊，細胞核位于胞體中央；模型組大鼠肝小葉結構破壞，肝細胞出現重度脂肪變性，細胞腫脹并出現氣球樣變，伴炎細胞浸潤；陽性藥組、黃芩湯高劑量組大鼠肝細胞氣球樣變被明顯糾正，炎性浸潤降低，肝小葉結構大致恢復，肝細胞排列呈整齊放射狀；黃芩湯低劑量組肝細胞脂肪變性較模型組略有糾正，病變程度減低，以上說明多烯磷脂膽堿和黃芩湯可改善NAFLD大鼠肝臟組織的脂肪變性、炎細胞浸潤和氣球樣變性而發揮治療作用。

3.4 各組大鼠腸道菌群物種注釋與評估

各組大鼠腸道菌群優化后序列數目為2 011 100，堿基數目為834 790 362，平均長度為415 bp，序列長度分布在400～440 bp內，符合16S rRNA（V3～V4）要求，可知后續分析較為可靠。

如圖4-A所示，Rank-Abundance曲線可解釋物種豐富度和群落均勻度，本研究各組在橫軸上的范圍較大且平緩下降，表明各組大鼠腸道菌群物種豐富度高和物種分布均勻。如圖4-B、C所示，Pan物種分析可解釋樣本包含的物種總和，Core物種分析可解釋所有樣本共享物種數目，本研究各組總數目和共享項目增加或減少趨勢均逐步減緩并趨于平坦，表明各組樣本量滿足評估物種豐富度和核心物種數的要求。如圖4-D所示，Shannon曲線可反映微生物群落多樣性，其值與群落多樣性呈正相關，本研究各組曲線趨于平坦，表明各組數據量滿足測序要求，各組樣本微生物多樣性信息可得到較為全面地反映。

3.5 各組大鼠腸道菌群Alpha多樣性分析

如圖5-A所示，sobs指數可解釋微生物群落豐富度，相較于空白組，模型組sobs指數顯著降低（＜0.01），說明NAFLD大鼠腸道菌群豐富度顯著下降；相較于模型組，陽性藥組和黃芩湯低、高劑量組sobs指數顯著升高（＜0.05、0.01），說明多烯磷脂膽堿和黃芩湯可提升NAFLD大鼠腸道菌群的豐富度。如圖5-B所示，heip指數可解釋群落均勻度，相較于空白組，模型組heip指數顯著降低（＜0.01），說明NAFLD大鼠腸道菌群均勻度顯著下降；相較于模型組，陽性藥組和黃芩湯低、高劑量組heip指數顯著升高（＜0.05、0.01），說明多烯磷脂膽堿和黃芩湯可提升NAFLD大鼠腸道菌群的均勻度。如圖5-C所示，相較于空白組，模型組Shannon指數顯著降低（＜0.01），說明NAFLD大鼠腸道菌群多樣性顯著下降；相較于模型組，陽性藥組和黃芩湯低、高劑量組Shannon指數顯著升高（＜0.05、0.01），說明多烯磷脂膽堿和黃芩湯可提升NAFLD大鼠腸道菌群的多樣性。綜上，NAFLD大鼠腸道菌群的豐富度、均勻度和多樣性均明顯下降，黃芩湯具有調節NAFLD大鼠腸道菌群豐富度、均勻度和多樣性的作用。

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01；與陽性藥組比較：@P＜0.05 @@P＜0.01

圖3 各組大鼠肝臟組織病理改變(×200)

圖4 各組大鼠腸道菌群物種注釋與評估

3.6 各組大鼠腸道菌群Beta多樣性分析

如圖6所示，PCA分析可通過不同樣本群落組成分反映樣本間的差異和距離，樣本物種組成越相似，則在圖中距離越接近，主成分1（PC1）貢獻度為50.51%，主成分2（PC2）貢獻度為13.32%，二者貢獻度之和大于60%，故二者能較為全面地反映群落組成信息，空白組、模型組、陽性藥組及黃芩湯低、高劑量組所有樣本各自聚集在一起，模型組與空白組距離較遠，而空白組、陽性藥組及黃芩湯低、高劑量組距離較為接近，說明NAFLD大鼠腸道菌群組成發生改變，多烯磷脂膽堿和黃芩湯具有調控NAFLD大鼠腸道菌群組成的作用。

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與陽性藥組比較：@P＜0.05

圖6 各組大鼠腸道菌群Beta多樣性分析

3.7 各組大鼠腸道菌群物種組成及差異分析

3.7.1 門水平物種組成及差異分析 如圖7-A所示，群落柱形圖可解釋各組樣本的優勢物種及其相對豐度，各組大鼠腸道菌群的優勢物種主要歸屬為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、Epsilonbacteraeota、軟壁菌門（Tenericutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。如圖7-B所示，各組大鼠腸道菌群在門水平群落豐度有顯著差異（＜0.01）。如圖7-C所示，相較于空白組，模型組放線菌門群落豐度顯著升高（＜0.01），表明NAFLD大鼠腸道菌群放線菌門群落豐度顯著上升；相較于模型組，陽性藥組和黃芩湯高劑量組放線菌門群落豐度顯著降低（＜0.05、0.01），說明多烯磷脂膽堿和黃芩湯高劑量可降低NAFLD大鼠腸道菌群優勢物種放線菌門的群落豐度。

A-各組樣本的優勢物種及其相對豐度 B-各組樣本門水平群落豐度差異 C-各組放線菌門群落豐度差異 與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與陽性藥組比較：@@P＜0.01

KB-空白 MX-模型 YXY-陽性藥 DJL-黃芩湯5 g·kg?1 GJL-黃芩湯20 g·kg?1（下同） A-各組樣本的優勢物種及其相對豐度 B-各組樣本屬水平群落豐度差異 C～I-各組乳桿菌屬、unclassified-f-Lachnospiraceae、布勞特氏菌屬、Allobaculum、雙歧桿菌屬、Eubacterium coprostanoligenes group和瘤胃球菌屬群落豐度差異 與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與陽性藥組比較：@P＜0.05 @@P＜0.01

3.8 各組大鼠腸道菌群LEfSe多級物種差異判別分析

如圖9所示（LDA閥值：4；多組比較策略：All-against-all；保留門和屬水平差異物種），LEfSe多級物種差異判別分析可找出在門、綱、目、科、屬各個水平中對樣本劃分產生顯著性差異影響的群落或物種，相較于空白組，模型組unclassified-f-Lachnospiraceae、布勞特氏菌屬、、鏈球菌屬、、螺桿菌屬、group、瘤胃球菌屬豐度顯著下調，而乳桿菌屬豐度顯著上調，表明NAFLD大鼠上述腸道菌屬豐度發生顯著變化；相較于模型組，陽性藥組unclassified-f-Lachnospiraceae、、變形菌門、瘤胃球菌屬豐度顯著上調，黃芩湯低劑量組、、-6豐度顯著上調，黃芩湯高劑量組布勞特氏菌屬、unclassified-f-Lachnospiraceae、Ruminococcaceae-UCG-005、GCA-900066225、棒狀桿菌屬豐度顯著上調，表明多烯磷脂膽堿具有回調NAFLD大鼠腸道菌群unclassified-f-Lachnospiraceae、、瘤胃球菌屬豐度的作用，黃芩湯高劑量具有回調NAFLD大鼠腸道菌群布勞特氏菌屬、unclassified-f-Lachnospiraceae豐度的作用，而黃芩湯低劑量回調作用較弱。

3.9 各組大鼠腸道菌群與血脂、轉氨酶指標相關性分析

通過Pearson相關系數分析各組大鼠腸道菌群與血脂、轉氨酶指標相關性。如圖10所示，在門水平上，厚壁菌門與TC、ALT呈正相關（＜0.05）；放線菌門、髕骨細菌門（Patescibacteria）與TG、LDL-C、AST呈正相關（＜0.05）；擬桿菌門與HDL-C呈正相關（＜0.05）；變形菌門與HDL-C呈正相關（＜0.05），與TG、LDL-C、AST、TC、ALT呈負相關（＜0.05）；迷蹤菌門（Elusimicrobia）與AST、ALT呈負相關（＜0.05）；Epsilonbacteraeota、Kiritimatiellaeota與AST、TC、ALT呈負相關（＜0.05、0.01）；在屬水平上（取屬水平豐度前20），乳桿菌屬、雙歧桿菌屬與AST、TG、LDL-C、TC、ALT呈正相關（＜0.05、0.01），與HDL-C呈負相關（＜0.05、0.01）；unclassified-f-Lachnospiraceae、group、瘤胃球菌屬、Ruminococceae- NK4A214-group、norank-f-Desulfovibrionaceae與HDL-C呈正相關（＜0.05、0.01），與AST、TG、LDL-C、TC、ALT呈負相關（＜0.05、0.01）；布勞特氏菌屬與HDL-C呈正相關（＜0.05），與TG、LDL-C、TC、ALT呈負相關（＜0.05、0.01）；Ruminococcaceae-UCG-014與AST、TG呈正相關（＜0.05）；unclassified-f-Ruminococceaeae與HDL-C呈正相關（＜0.05），與LDL-C、TC呈負相關（＜0.05）；鏈球菌屬與AST、TG、LDL-C、TC、ALT呈負相關（＜0.05）；norank-f-Lachnospiraceae與HDL-C呈正相關（＜0.05）。以上結果顯示，大鼠腸道菌群變化與NAFLD血脂和肝功能異常存在相關性。

g-屬水平物種 p-門水平物種

*P＜0.05 **P＜0.01

3.10 各組大鼠腸道菌群功能富集差異分析

3.10.1 KEGG功能富集差異分析 KEGG數據庫是系統分析基因功能、聯系基因組信息和功能信息的大型知識庫。本研究將每個樣本OTU豐度標準化后獲取對應ID，并根據OTU豐度計算KEGG功能類別的豐度。如圖11所示，各組大鼠腸道菌群KEGG功能主要富集在氨基酸代謝、碳水化合物代謝、細胞過程和信號、能量代謝等11個功能類別；相較于空白組，模型組上述11個KEGG功能水平均有顯著下調（＜0.05、0.01），說明NAFLD大鼠腸道菌群在上述11個KEGG功能上發生異常；相較于模型組，陽性藥組和黃芩湯高劑量組上述11個KEGG功能水平均顯著上調（＜0.05、0.01），表明多烯磷脂膽堿和黃芩湯高劑量具有調控NAFLD大鼠腸道菌群上述11個KEGG功能的作用。

3.10.2 COG功能富集差異分析 直系同源蛋白分組比對（evolutionary genealogy of genes: non-supervised orthologous groups，EggNOG）數據庫是國際上普遍認可的同源聚類基因群的專業注釋數據庫，可基于此數據庫進行COG的功能分類和功能注釋。本研究將每個樣本OTU豐度標準化后獲取對應ID，并根據OTU豐度計算COG功能類別的豐度。如圖12所示，各組大鼠腸道菌群COG功能主要富集在能量生產與轉換、氨基酸轉運與代謝、碳水化合物運輸與代謝、輔酶轉運與代謝等10個功能類別；相較于空白組，模型組上述10個COG功能水平均顯著下調（＜0.05、0.01），表明NAFLD大鼠腸道菌群在上述10個COG功能上發生異常；相較于模型組，陽性藥組和黃芩湯高劑量組上述10個COG功能水平均顯著上調（＜0.05、0.01），表明多烯磷脂膽堿和黃芩湯高劑量可通過調控NAFLD大鼠腸道菌群上述10個COG功能發揮治療NAFLD的作用。

與空白組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與陽性藥組比較：@P＜0.05 @@P＜0.01，下同

圖12 各組大鼠腸道菌群COG功能富集差異分析()

4 討論

近年來，大量研究揭示了腸道菌群在NAFLD等代謝性疾病發生發展中發揮重要作用。肥胖是導致NAFLD等代謝性疾病的重要原因之一，腸道菌群可通過短鏈脂肪酸等代謝產物調節宿主能量獲取或調控宿主能量代謝信號通路，最終在肥胖及肥胖相關代謝性疾病中發揮關鍵作用[16]。腸道菌群中革蘭陰性菌的過度繁殖，會增加肝毒性產物如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的產生，研究顯示LPS與其靶蛋白結合，進而與單核細胞分化抗原復合物結合，可引發胰島素抵抗與炎癥反應[17]。胰島素抵抗是代謝性疾病的基本病理生理過程，可加速NAFLD患者肝細胞的脂肪堆積和炎癥，最終使得NAFLD進一步惡化[18]。膽堿在脂質代謝中發揮重要作用，可促進肝細胞中的脂質轉運并防止脂質在肝臟中的異常積累，而膽堿缺乏通常會導致肝臟脂肪變性誘發NAFLD[19]。腸道菌群也參與膽堿代謝，將其轉化為有毒的二甲胺和三甲胺，這些物質在肝臟中進一步轉化為三甲胺氧化物，導致肝臟炎癥和損傷，加劇NAFLD進展[20]。膽汁酸由膽固醇合成，具有廣泛的生理功能，不僅能促進脂溶性食物的消化，亦能保護腸道屏障，防止細菌的移位[21]。此外，膽汁酸可以作為信號分子，通過激活膽汁酸受體和跨膜G蛋白偶聯膽汁酸受體5（transmembrane G protein-coupled receptor 5，TGR5）來調節膽汁酸代謝的平衡[22]。有證據顯示，抗生素可通過改變膽汁酸的組成和抑制類法尼醇X受體（farnesoid X receptor，FXR）來減弱高脂飲食誘導的NAFLD發展[22]。而腸道菌群則可以通過將初級膽汁酸解偶聯并代謝為腸道中的次級膽汁酸來影響膽汁酸池的穩態，從而調節機體脂質和能量代謝，最終參與NAFLD發生發展[23]。綜上，腸道菌群可通過介導胰島素抵抗、炎癥、膽堿和膽汁酸代謝等過程參與NAFLD的發生發展，腸道菌群可能成為NAFLD的潛在治療靶點。

黃芩湯由黃芩、白芍、炙甘草和大棗組成，單味藥“個性之專長”是組方“合群之妙用”的根本，單味藥中復雜的化學成分正是其發揮多種藥理作用和多方面功效的重要基礎[24]。研究顯示，黃芩可通過腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）介導的固醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBP）信號通路調節游離脂肪酸代謝從而改善NAFLD[25]；而黃芩中的黃芩素也可通過激活AMPK和抑制SREBP1減少肝臟脂肪積累，以及影響抗氧化活性等作用改善NAFLD[26]。白芍中的芍藥苷則可通過抑制干預脂質代謝、促進脂肪酸氧化、增加膽固醇合成、降低血糖和抑制炎癥反應阻止NAFLD疾病發展并降低發生動脈粥樣硬化的風險[27]。甘草中甘草酸可通過減少肝臟脂肪生成、增加脂肪酸氧化、促進三酰甘油代謝、減少糖異生、增加糖原合成和胰島素敏感性，實現對NAFLD的保護作用[28]。綜上可知，黃芩湯可通過多種途徑對NAFLD產生潛在的治療作用。亦有研究顯示，黃芩湯可增加腸道內有益菌豐度并降低有害菌豐度，恢復腸道內微生態而實現對2型糖尿病、冠心病和潰瘍性結腸炎的治療作用[8,29-30]。黃芩湯經人腸道菌群作用后的代謝產物能顯著降低-半乳糖胺誘導的肝損傷小鼠的ALT水平，表明黃芩湯腸道菌群代謝產物是其發揮保肝作用的重要物質基礎[12]。此外，利用黃芩湯組分中的甘草酸干預可顯著改變NAFLD小鼠腸道菌群的組成，降低厚壁菌門與擬桿菌門的比率和產生內毒素的細菌的豐度，提高有益菌和產生短鏈脂肪酸細菌的豐度，并促進短鏈脂肪酸的產生，最終改善NAFLD[31]。因此，黃芩湯有望通過改善腸道菌群發揮對NAFLD的治療作用。

本研究成功建立了NAFLD大鼠模型，并基于16S rRNA技術評價黃芩湯對NAFLD大鼠腸道菌群的調節作用，從腸道菌群角度初步探討黃芩湯改善NAFLD的作用機制。本研究結果顯示，相較于正常大鼠，NAFLD大鼠腸道菌群的豐富度、均勻度和多樣性均明顯下降，表明NAFLD疾病進展過程會伴隨腸道菌群的失調。其中，在門水平上，NAFLD大鼠放線菌門群落豐度顯著提高，Epsilonbacteraeota豐度顯著降低；在屬水平上，NAFLD大鼠乳桿菌屬、和雙歧桿菌屬群落豐度顯著升高，unclassified-f-Lachnospiraceae、布勞特氏菌屬、group和瘤胃球菌屬群落豐度顯著降低。放線菌門的次級代謝產物是抗生素的重要來源，放線菌門豐度的提高可增加腸道內抗生素的產量，進而破壞腸道菌群的穩態，加劇相關疾病的進展[32]。乳桿菌和雙歧桿菌為腸道內的有益菌群，但NAFLD大鼠乳桿菌屬和雙歧桿菌屬豐度顯著增加，原因可能為機體處于代謝異常狀態下菌群產生了代償作用，自我調節并逐步逆轉機體的慢性炎癥狀態[33]。布勞特氏菌屬是一種具有益生菌特性的厭氧菌，諸多證據顯示其具有調節宿主健康和緩解代謝綜合征的能力[34]。瘤胃球菌屬與谷氨酰胺代謝關系密切，谷氨酰胺代謝失調與NAFLD進展為非酒精性脂肪肝炎有關[15,35]。除此之外，大鼠腸道菌群變化與NAFLD血脂和肝功能異常存在相關性，且NAFLD大鼠腸道菌群富集的代謝相關功能均有顯著下降。

本研究從大鼠體質量、血脂指標、肝功能指標及肝臟組織病理分析證實了黃芩湯對NAFLD大鼠具有較好的治療作用。此外，黃芩湯能夠提升NAFLD大鼠腸道菌群的豐富度、均勻度和多樣性，提升Epsilonbacteraeota、unclassified-f-Lachnospiraceae、布勞特氏菌屬、group和瘤胃球菌屬豐度，降低放線菌門、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬豐度，促進NAFLD大鼠腸道菌群向正常水平恢復。綜上，黃芩湯對NAFLD的治療作用與其對NAFLD大鼠腸道菌群失調的改善作用具有相關性。后期將采用糞菌定植法和無菌大鼠，結合16S rRNA和宏基因組測序技術從腸道菌群角度進一步驗證與研究黃芩湯治療NAFLD的作用機制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Loomba R, Friedman S L, Shulman G I. Mechanisms and disease consequences of nonalcoholic fatty liver disease [J]., 2021, 184(10): 2537-2564.

[2] Makri E, Goulas A, Polyzos S A. Epidemiology, pathogenesis, diagnosis and emerging treatment of nonalcoholic fatty liver disease [J]., 2021, 52(1): 25-37.

[3] Eslam M, Newsome P N, Sarin S K,. A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement [J]., 2020, 73(1): 202-209.

[4] Athyros V G, Alexandrides T K, Bilianou H,. The use of statins alone, or in combination with pioglitazone and other drugs, for the treatment of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis and related cardiovascular risk. An expert panel statement [J]., 2017, 71: 17-32.

[5] Fan Y, Pedersen O. Gut microbiota in human metabolic health and disease [J]., 2021, 19(1): 55-71.

[6] Lynch S V, Pedersen O. The human intestinal microbiome in health and disease [J]., 2016, 375(24): 2369-2379.

[7] Wang R, Tang R, Li B,. Gut microbiome, liver immunology, and liver diseases [J]., 2021, 18(1): 4-17.

[8] 曹敏, 薛俊, 董蕎菁, 等. 黃芩湯聯合二甲雙胍治療2型糖尿病療效及對腸道菌群構成、胰島素信號轉導分子水平影響 [J]. 中華中醫藥學刊, 2019, 37(11): 2792-2795.

[9] 徐靜波, 瞿溢謙, 葉海勇. 黃芩湯橐龠探析 [J]. 新中醫, 2020, 52(3): 19-21.

[10] Li T, Zhuang S X, Wang Y W,. Flavonoid profiling of a traditional Chinese medicine formula of Huangqin Tang using high performance liquid chromatography [J]., 2016, 6(2): 148-157.

[11] 李巖, 郭鵬, 田月洋. 黃芩湯聯合序貫肝動脈化療栓塞術對原發性肝癌患者核因子κB及細胞缺氧誘導因子-1α的影響 [J]. 中華中醫藥雜志, 2019, 34(8): 3870-3873.

[12] 左風, 周鐘鳴, 熊玉蘭, 等. 黃芩湯及其腸道菌群的代謝產物對-半乳糖胺誘導的肝損傷的保護作用的比較研究 [J]. 中國中藥雜志, 2003, 28(9): 842-844.

[13] 吳娜, 萬治平, 韓玲, 等. 黃芩湯對潰瘍性結腸炎小鼠NLRP3/caspase-1細胞焦亡通路的影響 [J]. 中國中藥雜志, 2021, 46(5): 1191-1196.

[14] 王怡薇, 張會會, 王彥禮, 等. 黃芩湯對潰瘍性結腸炎大鼠NF-κBp65調控作用研究 [J]. 藥學學報, 2015, 50(1): 21-27.

[15] 袁鵬, 馬瑜璐, 劉圣金, 等. 礦物藥青礞石對戊四唑點燃癲癇大鼠腸道菌群的影響 [J]. 中草藥, 2021, 52(7): 2011-2023.

[16] Ma J L, Zhou Q H, Li H K. Gut microbiota and nonalcoholic fatty liver disease: Insights on mechanisms and therapy [J]., 2017, 9(10): 1124.

[17] Caesar R, Reigstad C S, B?ckhed H K,. Gut-derived lipopolysaccharide augments adipose macrophage accumulation but is not essential for impaired glucose or insulin tolerance in mice [J]., 2012, 61(12): 1701-1707.

[18] Tarantino G, Caputi A. JNKs, insulin resistance and inflammation: A possible link between NAFLD and coronary artery disease [J]., 2011, 17(33): 3785-3794.

[19] Corbin K D, Zeisel S H. Choline metabolism provides novel insights into nonalcoholic fatty liver disease and its progression [J]., 2012, 28(2): 159-165.

[20] Kolodziejczyk A A, Zheng D P, Shibolet O,. The role of the microbiome in NAFLD and NASH [J]., 2019, 11(2): e9302.

[21] Fuchs C, Claudel T, Trauner M. Bile acid-mediated control of liver triglycerides [J]., 2013, 33(4): 330-342.

[22] Jiang C, Xie C, Li F,. Intestinal farnesoid X receptor signaling promotes nonalcoholic fatty liver disease [J]., 2015, 125(1): 386-402.

[23] Ferslew B C, Xie G X, Johnston C K,. Altered bile acid metabolome in patients with nonalcoholic steatohepatitis [J]., 2015, 60(11): 3318-3328.

[24] 段金廒. 中藥資源化學: 理論基礎與資源循環利用 [M]. 北京: 科學出版社, 2015: 151.

[25] Chen Q, Liu M, Yu H,.regulates FFA metabolism to ameliorate NAFLD through the AMPK-mediated SREBP signaling pathway [J]., 2018, 72(3): 655-666.

[26] Sun W L, Liu P P, Wang T Q,. Baicalein reduces hepatic fat accumulation by activating AMPK in oleic acid-induced HepG2 cells and high-fat diet-induced non-insulin-resistant mice [J]., 2020, 11(1): 711-721.

[27] Zhang L, Yang B, Yu B. Paeoniflorin protects against nonalcoholic fatty liver disease induced by a high-fat diet in mice [J]., 2015, 38(7): 1005-1011.

[28] Sun X, Duan X, Wang C,. Protective effects of glycyrrhizic acid against non-alcoholic fatty liver disease in mice [J]., 2017, 806: 75-82.

[29] 徐航宇, 王彥禮, 王敦方, 等. 高通量測序技術研究黃芩湯對潰瘍性結腸炎大鼠腸道菌群的影響 [J]. 藥學學報, 2017, 52(11): 1673-1682.

[30] 程艷, 王浩, 陳文靜, 等. 黃芩湯基于調控apelin-13、Ghrelin、Obestatin的表達及腸道菌群構成改善冠心病機制研究 [J]. 中華中醫藥學刊, 2019, 37(9): 2089-2092, 2308.

[31] Li Y, Liu T, Yan C,. Diammonium glycyrrhizinate protects against nonalcoholic fatty liver disease in mice through modulation of gut microbiota and restoration of intestinal barrier [J]., 2018, 15(9): 3860-3870.

[32] Katsuyama Y. Mining novel biosynthetic machineries of secondary metabolites from actinobacteria [J]., 2019, 83(9): 1606-1615.

[33] 戴新新, 蔡紅蝶, 宿樹蘭, 等. 地黃葉對糖尿病腎病大鼠腸道菌群的調節作用 [J]. 藥學學報, 2017, 52(11): 1683-1691.

[34] Liu X, Mao B, Gu J,.-a new functional genus with potential probiotic properties? [J]., 2021, 13(1): 1-21.

[35] Simón J, Martínez-Chantar M L, Delgado T C. Glutamine, fatty liver disease and aging [J]., 2021, 13(3): 3165-3166.

Effects of Huangqin Decoction on gut microbiota in rats with nonalcoholic fatty liver disease

YAN Bao-fei1, 2, YUAN Peng2, LIU Sheng-jin2, LIU Jia1, DUAN Jin-ao2, MAO Yi-bei1, LING Xu-heng1

1. Jiangsu Health Vocational College, Nanjing 211800, China 2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, and Key Laboratory of Chinese Medicinal Resources Recycling Utilization, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To investigate the effect of Huangqin Decoction (黃芩湯) on gut microbiota in rats with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD).The rats were randomly divided into blank group, model group, positive drug group (polyene lecithin choline, 8 mg/kg), low-dose (5 g/kg) and high-dose (20 g/kg) Huangqin Decoction group, and the rats were fed with high-fat diet for nine weeks to establish the NAFLD model. After five weeks of oral administration, the plasma lipids and liver function indexes were detected by fully automatic biochemical analyzer, the pathological changes of liver tissues were analyzed by HE staining and the changes of gut microbiota in rats were analyzed by 16S rRNA sequencing.Compared with the model group, the weight of rats of low-dose and high-dose Huangqin Decoction group were significantly lower (< 0.05, 0.01), the level of total cholesterol (TC), triacylglycerol (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), alanine transaminase (ALT) and aspartate transaminase (AST) were significantly reduced (< 0.01), the level of HDL-C was elevated remarkably (< 0.01), the steatosis and ballooning degeneration of hepatocyte in liver tissues were corrected, and the inflammatory cell infiltration was decreased. 16S rRNA results showed that compared with the blank group, the gut microbiota in model group were changed; compared with the model group, the sobs, heip and Shannonindices of the gut microbiota in rats of low-dose and high-dose Huangqin Decoction group were significantly higher (< 0.05, 0.01), the abundance of unclassified-f-Lachnospiraceae,,group andin rats of high-dose Huangqin Decoction group increased significantly (< 0.05, 0.01), the abundance of Actinobacteria,andin rats of high-dose Huangqin Decoction group decreased significantly (< 0.05, 0.01). The functional level of Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) and clusters of orthologous groups (COG) enrichment related to gut microbiota in rats of high-dose Huangqin Decoction group elevated significantly (< 0.05, 0.01).Huangqin Decoction might play a role in the treatment of NAFLD by regulating gut microbiota of rats with NAFLD.

Huangqin Decoction; nonalcoholic fatty liver disease; 16S rRNA; gut microbiota; baicalin; wogonoside; baicalein; wogonin; paeoniflorin; liquiritin; glycyrrhizic acid

R285

A

0253 - 2670(2022)01 - 0162 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.020

2021-09-18

江蘇省高校“青藍工程”優秀教學團隊培養對象（蘇教師[2020]42號）；江蘇省中醫藥科技發展計劃項目（YB2020100）；江蘇衛生健康職業學院校級課題重點項目（JKB202003）

嚴寶飛，男，江蘇淮安人，碩士，助教，主要從事中藥資源學研究。Tel: (025)68172750 E-mail: baofeiy@163.com

劉 嘉，男，江蘇南京人，碩士，副教授，主要從事中藥資源學研究。Tel: (025)68172750 E-mail: liujia402@163.com

[責任編輯 潘明佳]