羅非魚羅湖病毒的診斷及其防控建議

秦真東，林 蠡

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225)

近年來(lái)隨著羅非魚養(yǎng)殖密度和規(guī)模的不斷擴(kuò)大，多種病害的頻繁暴發(fā)給全球羅非魚健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重威脅。值得注意的是，2009年以來(lái)，在以色列、厄瓜多爾和埃及等國(guó)相繼暴發(fā)養(yǎng)殖和野生羅非魚大量死亡事件，對(duì)全球羅非魚養(yǎng)殖構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。直到2014年，Marina Eyngo等通過(guò)分離鑒定才發(fā)現(xiàn)其病原是新型RNA病毒，并將該病毒命名為羅湖病毒(Tilapia lake virus，TiLV)。目前，該病毒相關(guān)研究還十分缺乏，特別是在我國(guó)廣泛養(yǎng)殖的羅非魚中的感染情況還未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道，也缺乏有關(guān)其綜合防控策略。本文從羅非魚感染羅湖病毒后的病理變化及其檢測(cè)方法建立，結(jié)合目前的研究現(xiàn)狀對(duì)羅非魚羅湖病毒提出綜合防控建議。

一、實(shí)驗(yàn)魚感染

挑選健康的吉富羅非魚(廣東羅非魚良種場(chǎng))，體質(zhì)量(30±5)克，隨機(jī)分為兩組，每組10尾。感染組每尾魚腹腔注射200微升TiLV(病毒濃度1×106拷貝/毫升)，對(duì)照組注射等量滅菌的PBS。感染7天后，觀察魚體的臨床病理變化情況，并采集脾臟用于后續(xù)檢測(cè)。

二、臨床變化情況

羅非魚在羅湖病毒感染7天后發(fā)生顯著的臨床病理變化，如圖1所示。與對(duì)照組相比，感染羅湖病毒后，魚體活力明顯下降，嗜睡、眼部病變充血渾濁、皮膚糜爛和體色發(fā)黑，魚體黏液脫落明顯，鱗片脫落嚴(yán)重，尾鰭部分殘缺，身體表面出現(xiàn)明顯的出血現(xiàn)象。解剖后發(fā)現(xiàn)，整個(gè)鰓絲嚴(yán)重出血，內(nèi)臟組織出血嚴(yán)重，特別是腸道膨脹出血，腸壁變薄，沒(méi)有明顯腹水存在，肛門紅腫不顯著。羅非魚感染羅湖病毒的大量死亡可能與呼吸功能衰竭以及內(nèi)臟功能紊亂有一定關(guān)系，但是具體的原因還需要進(jìn)一步深入研究。

三、羅湖病毒的檢測(cè)

將采集的脾臟組織提取總RNA，根據(jù)HIScript?Q Select RT SuperMix(諾唯贊，南京)說(shuō)明書進(jìn)行cDNA合成。采用套式RT-PCR方法對(duì)羅湖病毒進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 羅非魚感染羅湖病毒后的臨床變化

第一步反應(yīng)：在0.2毫升PCR薄壁管中，按每個(gè)樣品20微升擴(kuò)增體系配置，包括2×Taq Mix 10微升、10微摩/升上游引物(TiLV Nested ext-1)和下游引物(ME1)各1微升、雙蒸水6微升、cDNA模板2微升。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃3分鐘；95℃30秒，55℃30秒，72℃0秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘，1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。結(jié)果顯示，感染的兩條羅非魚均擴(kuò)出1條450 bp的條帶(圖2)，而非感染羅非魚沒(méi)有檢測(cè)到條帶，通過(guò)在NCBI比對(duì)顯示與TiLV比對(duì)率為99%。

第二步反應(yīng)：在0.2毫升PCR薄壁管中，按每個(gè)樣品20微升擴(kuò)增體系配置，包括2×Taq Mix 10微升、10微摩/升上游引物(ME2)和下游引物(ME1)各1微升、雙蒸水6微升、cDNA模板(稀釋1 000倍)2微升。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃3分鐘；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘，1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。結(jié)果顯示，在感染的兩條羅非魚均擴(kuò)出1條250 bp的條帶(圖2)，而非感染羅非魚沒(méi)有檢測(cè)到條帶，通過(guò)在NCBI比對(duì)顯示與TiLV比對(duì)率為99%。

套式RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)中的羅非魚確實(shí)感染了羅湖病毒，并且能夠特異性檢測(cè)出羅湖病毒。

圖2 TiLV套式PCR檢測(cè)結(jié)果

四、防控建議

目前沒(méi)有針對(duì)羅湖病毒的有效防治方法，因此只能通過(guò)建立綜合防控策略，減少羅湖病毒對(duì)羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成的威脅。筆者對(duì)羅湖病毒的防控建議如下。

1.建立羅湖病毒流行病學(xué)調(diào)查

目前在埃及、厄瓜多爾、以色列等多地研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚大量死亡主要發(fā)生在天氣炎熱的5-10月，因此猜測(cè)羅湖病毒主要暴發(fā)于溫度相對(duì)比較高的季節(jié)，而目前關(guān)于國(guó)內(nèi)的流行情況仍然不清楚。因此，開展國(guó)內(nèi)不同區(qū)域流行的情況對(duì)于防范羅湖病毒具有重要意義。流行病學(xué)調(diào)查的內(nèi)容主要包括流行季節(jié)、水溫情況、水質(zhì)環(huán)境情況、水域環(huán)境等，其次羅非魚的養(yǎng)殖密度、規(guī)模以及魚體尺寸等情況也是十分重要的調(diào)查對(duì)象。目前研究發(fā)現(xiàn)該病毒可以通過(guò)一個(gè)養(yǎng)殖池?cái)U(kuò)散到另一個(gè)養(yǎng)殖池，并且不同生長(zhǎng)期的羅非魚也存在差異，因此開展羅湖病毒病流行病學(xué)調(diào)查對(duì)于防控羅湖病毒大規(guī)模暴發(fā)具有重要作用。

2.建立快速精準(zhǔn)的檢測(cè)方法

目前人們?cè)诓≡瓩z測(cè)方面已建立多種檢測(cè)方法，但是對(duì)羅湖病毒的檢測(cè)方法還十分缺乏。目前已經(jīng)建立的方法有實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、套式RT-PCR等，目前的檢測(cè)方法主要是建立在核酸水平，因此仍需開發(fā)更快速、精準(zhǔn)的檢測(cè)方法。除了核酸檢測(cè)方法外，仍需建立蛋白質(zhì)水平上的檢測(cè)方法，比如建立在特異性抗體上的ELISA檢測(cè)法、免疫熒光法以及免疫膠體金等方法。同時(shí)，建立對(duì)羅湖病毒敏感的細(xì)胞系也是檢測(cè)羅湖病毒重要的方法之一，可以更深入研究羅湖病毒的入侵機(jī)制。

3.加快技術(shù)攻關(guān)及有效藥物的篩選

羅湖病毒的大量暴發(fā)對(duì)羅非魚的健康養(yǎng)殖造成嚴(yán)重威脅，雖然目前在國(guó)內(nèi)的暴發(fā)記錄不多，但是仍然需要做好技術(shù)攻關(guān)以應(yīng)對(duì)其大量暴發(fā)。需要弄清楚羅湖病毒的感染途徑、復(fù)制方式以及致病機(jī)制。根據(jù)羅湖病毒的作用特征，開發(fā)應(yīng)對(duì)的有效藥物，比如開發(fā)有效的中草藥，一方面可以增強(qiáng)魚體免疫力，另一方面可以直接抑制羅湖病毒的感染。同時(shí)，可以篩選合適的飼料添加劑，比如多糖類藥物等，提高魚的免疫力，減少魚的死亡率。

4.保持良好養(yǎng)殖水域環(huán)境

良好的養(yǎng)殖水域環(huán)境是緩解病害發(fā)生重要因素，如何保持良好的水質(zhì)，顯得十分重要。足夠的溶氧，合適的養(yǎng)殖水溫，定期檢測(cè)氨氮、亞硝酸鹽等水質(zhì)指標(biāo)，定期對(duì)水質(zhì)進(jìn)行改良，一方面可以提高養(yǎng)殖魚的免疫力，另一方面也可以減少對(duì)魚體的應(yīng)激。同時(shí)，控制合適的養(yǎng)殖密度，投喂優(yōu)質(zhì)飼料以及合適的投食量也是保持水質(zhì)良好重要的因素。總之，實(shí)時(shí)保持水質(zhì)良好對(duì)于防控羅湖病毒的暴發(fā)也至關(guān)重要。

5.開發(fā)高效特異的疫苗

高效特異的疫苗仍然是防控病毒暴發(fā)的最有效途徑。疫苗種類繁多，包括弱毒疫苗、亞單位疫苗、滅活疫苗、DNA疫苗等，各有特點(diǎn)，均可以在防控羅湖病毒中發(fā)揮重要作用。此外，開發(fā)高效特異性的卵黃抗體也是防控羅湖病毒的良好選擇。總之，開發(fā)高效特異的疫苗是防控羅湖病毒眾多防控手段中最直接、最有效的選擇。

6.其他

防控羅湖病毒除了上述手段外，還需要做到精細(xì)化管理，開發(fā)更加優(yōu)質(zhì)的羅非魚苗種，做好病毒溯源、親魚和苗種的監(jiān)測(cè)等，通過(guò)多種防控方法，共同防控羅湖病毒。

五、總結(jié)

經(jīng)過(guò)學(xué)者多年的不懈研究，目前已經(jīng)初步建立了羅湖病毒的分離鑒定以及檢測(cè)方法，相信隨著研究的不斷深入，將會(huì)出現(xiàn)更多快速精準(zhǔn)的檢測(cè)方法和防控手段，共同為羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展保駕護(hù)航。