水產常見消毒劑對魚源柱狀黃桿菌的抑菌和殺菌效果研究

劉麗娟，王亞軍，石存斌，王 慶，張德鋒

(1.天津農學院水產學院，天津 300380；2.中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業(yè)農村部漁藥創(chuàng)制重點實驗室，廣東省水產動物免疫技術重點實驗室，廣東 廣州 510380)

柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)廣泛分布于淡水水體、土壤等自然環(huán)境中，而且具有滑動能力和團聚性等特征，能夠感染多種養(yǎng)殖魚，是一種全球性的重要魚類細菌性病原。柱狀黃桿菌為條件致病菌，由該菌引起的魚類柱形病在我國廣泛流行，可造成被感染魚出現爛鰓、體表潰瘍等癥狀，體表病灶白色至黃色糜爛，嚴重時可引起全身感染。目前，魚類柱形病的防治主要依賴于抗生素和消毒劑等化學藥物，然而隨著我國加強了對水產養(yǎng)殖用投入品的監(jiān)管以及建立了水產養(yǎng)殖用投入品使用白名單，越來越多的抗生素被限制使用，尚有一些消毒劑可以使用。在實際水產養(yǎng)殖中，化學類消毒劑的應用可有效抑制或殺滅病原菌，起到防治細菌性疾病的效果，增加養(yǎng)殖經濟效益。不同消毒劑的作用機制存在較大差異，篩選和開發(fā)具有高穩(wěn)定性和抗菌效果優(yōu)良的消毒劑，對于防控魚類柱形病具有重要的現實意義。本研究通過分析常見水產消毒劑對魚類柱狀黃桿菌的抑菌和殺菌效果，以期為魚類柱形病的科學防控提供依據，促進水產養(yǎng)殖的健康可持續(xù)發(fā)展。

一、材料與方法

1.實驗菌株與消毒劑

柱狀黃桿菌Fc001、Fc2020、MR2017、YY2017、Ms1907a、Ms2008、Ci0901、Ci2015、Ci2007a、Ps01、Fla120602、GHS061212、Hn2101和GY2001，共14株，分離自2008-2021年患病魚的鰓部，并進行了菌種鑒定和保藏，其中柱狀黃桿菌YY2017、MR2017、Fc2020由天津市水產研究所惠贈。

消毒劑：二氧化氯①、二氧化氯②、二氧化氯③、三氯異氰尿酸①、三氯異氰尿酸②、溴氯海因、二溴海因、苯扎溴銨溶液、戊二醛-苯扎溴銨、聚維酮碘、復合碘、硫醚沙星①、硫醚沙星②、硫醚沙星③、濃戊二醛、濫申停、蛋氨酸碘、過氧化鈣、過硫酸氫鉀購自不同的水產消毒劑生產廠家。

2.實驗方法

(1)消毒劑的制備。將19種消毒劑母液或粉末分別用純水稀釋成8 192毫克/升的工作液，然后通過0.22微米的濾器進行過濾除菌。

(2)Shieh液體培養(yǎng)基的制備。稱取蛋白胨5克、酵母提取物0.5克、硫酸鎂0.3克、牛肉膏0.2克、磷酸氫二鉀0.1克、氯化鋇0.01克、醋酸鈉0.01克、碳酸氫鈉0.05克、磷酸二氫鉀0.05克、氯化鈣0.006 7克、硫酸鐵0.001克，加入1 000毫升蒸餾水中，pH調至7.2，121℃下滅菌25分鐘。

(3)病原菌的培養(yǎng)及菌懸液制備。將14株柱狀黃桿菌接種于Shieh固體培養(yǎng)基進行活化，28℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24小時后，接種于Shieh液體培養(yǎng)基，28℃搖床振蕩培養(yǎng)24小時，取1.5毫升新鮮菌液離心獲得菌體，使用無菌PBS重懸，調整菌液濃度為1×107CFU/毫升。

(4)消毒劑對柱狀黃桿菌的最小抑菌濃度(MIC)測定。首先每孔加50微升的Shieh液體培養(yǎng)基，消毒劑采用二倍稀釋法，在96孔板上進行系列梯度稀釋，每列消毒劑的含量依次為2 048、1 024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1毫克/升。然后接種50微升的菌液，使其終濃度為5×106CFU/毫升。陽性對照組為只加菌液、不加消毒劑，陰性對照組為只加消毒劑、不加菌液。28℃靜置培養(yǎng)36小時后觀察結果，實驗重復3次。因柱狀黃桿菌培養(yǎng)液不易通過肉眼觀察判斷菌液是否明顯變渾濁，因此通過酶標儀測定其OD600是否有顯著變化用于確定每種消毒劑對柱狀黃桿菌的MIC。當陽性對照為有細菌生長(培養(yǎng)基變渾濁)、陰性對照無細菌生長(培養(yǎng)基清亮)，實驗組中無菌生長的最低消毒劑濃度即為該消毒劑對柱狀黃桿菌的MIC。

(5)消毒劑對柱狀黃桿菌的最小殺菌濃度(MBC)測定。根據上述MIC實驗結果，選取MIC之前5個孔中的培養(yǎng)液各100微升，均勻涂布于Shieh固體純化培養(yǎng)基上，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)36小時，觀察是否有菌落出現。在Shieh固體平板上無菌落生長的最低消毒劑濃度即為該消毒劑對柱狀黃桿菌的MBC。

二、結果與分析

1.消毒劑對柱狀黃桿菌的MIC

由實驗結果可知，陽性對照OD600均有明顯變化，表明細菌生長良好；陰性對照OD600無明顯變化，表明無菌生長(培養(yǎng)基和操作過程中沒有細菌污染)。不同消毒劑對魚源柱狀黃桿菌的MIC(表1)不同。苯扎溴銨對柱狀黃桿菌的抑菌效果最好，其MIC為2～4毫克/升；其次為戊二醛-苯扎溴銨、濫申停(主要成分為戊二醛-苯扎溴銨)，MIC均為16～32毫克/升；二氧化氯①、二氧化氯②、蛋氨酸碘和過氧化鈣對柱狀黃桿菌的抑菌效果一般，其MIC分別為64～128毫克/升、64～512毫克/升、64～128毫克/升和128～512毫克/升；二氧化氯③、三氯異氰尿酸①、溴氯海因、硫醚沙星②對柱狀黃桿菌的抑菌效果不理想，僅對部分菌株有抑菌效果，對大部分菌株抑菌濃度在1 024毫克/升以上；三氯異氰尿酸②、二溴海因、聚維酮碘、復合碘、硫醚沙星①、硫醚沙星③、濃戊二醛、過硫酸氫鈉對柱狀黃桿菌的抑菌效果較差，其MIC超過2 048毫克/升。

以上19種消毒劑的MIC實驗結果表明：苯扎溴銨和戊二醛-苯扎溴銨混合制劑在較低濃度下可以有效抑制柱狀黃桿菌生長，抑菌效果顯著。三氯異氰尿酸②、二溴海因、聚維酮碘、復合碘、硫醚沙星和濃戊二醛對柱狀黃桿菌的抑菌效果較差。

2.消毒劑對柱狀黃桿菌的MBC

MBC即為供試藥物殺滅99.9%或以上受試菌所需要的最低濃度。不同消毒劑對魚源柱狀黃桿菌的MBC(表2)不同。實驗結果顯示：苯扎溴銨對柱狀黃桿菌的殺菌效果最好，其MBC為2～4毫克/升；戊二醛-苯扎溴銨、濫申停的殺菌效果次之，MBC均為16～32毫克/升；二氧化氯①、二氧化氯②、蛋氨酸碘和過氧化鈣對柱狀黃桿菌的抑菌效果一般，其MBC分別為64～256毫克/升、64～512毫克/升、64～256毫克/升和128～512毫克/升；二氧化氯③、三氯異氰尿酸①、溴氯海因、硫醚沙星②、三氯異氰尿酸②、二溴海因、聚維酮碘、復合碘、硫醚沙星①、硫醚沙星③、濃戊二醛和過硫酸氫鉀對柱狀黃桿菌的殺菌效果較差，對絕大部分菌株MBC超過了1 024毫克/升，甚至超過2 048毫克/升。綜上可知，苯扎溴銨對柱狀黃桿菌的殺菌效果最好。

三、討論

本研究選取當前市場上常見的水產消毒劑，通過抑菌和殺菌實驗篩選高效的消毒劑，為有效控制養(yǎng)殖水體中的柱狀黃桿菌，科學指導用藥，及時采取有效措施控制病情，減少由柱狀黃桿菌引起的魚類柱形病提供參考依據，對實現水產經濟動物健康養(yǎng)殖、保障食品安全具有重要意義。

表1 不同消毒劑對柱狀黃桿菌的MIC 毫克/升

表2 不同消毒劑對柱狀黃桿菌的MBC 毫克/升

柱狀黃桿菌分離平板 柱狀黃桿菌純培養(yǎng)菌落形態(tài)

分析19種常用消毒劑對14株不同魚源柱狀黃桿菌進行抑菌、殺菌效果，MIC實驗結果表明：苯扎溴銨對柱狀黃桿菌的抑菌效果最好；戊二醛-苯扎溴銨、濫申停效果次之；氯制劑、碘制劑、溴氯海因和硫醚沙星等抑菌效果一般；戊二醛、過硫酸氫鉀等藥物對柱狀黃桿菌的抑菌效果較差。MBC實驗結果表明：苯扎溴銨對柱狀黃桿菌的殺菌效果最好；戊二醛-苯扎溴銨、濫申停(主要成分為戊二醛-苯扎溴銨)效果次之；氯制劑、碘制劑和過氧化鈣的殺菌效果一般；硫醚沙星、戊二醛和過硫酸氫鉀等藥物的殺菌效果較差。

苯扎溴銨、戊二醛-苯扎溴銨和濫申停等消毒劑對柱狀黃桿菌具有較好的抑菌、殺菌效果，但是濃戊二醛對柱狀黃桿菌的抑菌效果較差，表明戊二醛-苯扎溴銨和濫申停等消毒劑中主要起抑菌和殺菌作用的是苯扎溴銨。本研究表明苯扎溴銨在較低濃度下可以有效抑制和殺滅柱狀黃桿菌，其效果明顯優(yōu)于其他消毒劑。本研究還進行了同種類型消毒劑的橫向比較，結果表明不同來源的同類消毒劑，其抑菌和殺菌效果有一定的差異，因此，在選用消毒劑時應注意甄別不同產品的優(yōu)劣，應選擇具有較好療效的消毒劑產品。本研究表明不同魚源柱狀黃桿菌對同類消毒劑的藥物敏感性存在一定的差異，這提示養(yǎng)殖業(yè)者應加強魚源柱狀黃桿菌的藥物敏感性監(jiān)測，提高用藥的精準度。本研究為水產養(yǎng)殖過程中精準使用消毒劑用于科學防控柱形病提供了參考依據。

本研究在減少水產品藥物的使用量，強化漁藥的合理、規(guī)范使用，以及提升水產品質量具有重要意義。然而，在實際養(yǎng)殖過程中，應動態(tài)監(jiān)測魚類病害，確定其主要致病菌，并及時分析病原菌的藥物敏感性，根據不同養(yǎng)殖品種、水質條件和天氣變化，制定規(guī)范、科學、合理的用藥技術方案，實現魚類柱形病的精準防控，促進水產品質量安全。