5-羥色胺運載蛋白基因啟動子區多態性與銀屑病遺傳易感性的研究*

陶 喆，王玉鵬，黎威巍，陳舒麗，單士剛，包永芬**

(1．湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2．湖北科技學院臨床醫學院；3．湖北科技學院基礎醫學院)

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)在中樞和外周神經系統中起到調節因子的作用，近年來的研究發現它也影響T和B細胞的功能，從而對免疫系統產生影響。5-HT運載蛋白對5-HT具有關鍵調控作用，并且在免疫細胞廣泛表達。5-HT運載蛋白啟動子區多態性與人的精神抑郁狀態存在關聯[1-4]。銀屑病是一種復雜性疾病，發病機制涉及遺傳、免疫、內分泌等因素。鑒于銀屑病是一種在某種程度上由自身免疫系統慢性調節障礙導致的炎癥性皮膚過度增生性疾病和病人一般有精神狀態抑郁的特征，本研究重點從分子水平分析銀屑病病人5-HT運載蛋白啟動子區多態性與正常人此區域的多態性，以期驗證5-HT運載蛋白啟動子區多態性與銀屑病的相關性。

1 材料與方法

1.1 入選標準

①湖北地區、漢族；②無銀屑病等自身免疫性疾病家族史；③所有參與研究的個體間無親緣關系，無任何符合診斷標準的精神疾病，既往無精神疾病及家族病史；④患者典型臨床表現為紅斑、鱗屑等，除此之外還包括Auspitz征等典型表現，病史為反復發作、遷延不愈。

1.2 一般資料

參與本研究的尋常型銀屑病患者(觀察組)均選取自2015年9月至2016年12月在湖北科技學院附屬醫院皮膚性病科和中國人民解放軍一九五醫院皮膚科就診的患者。100例中男50例，女50例；平均發病年齡(43±11)歲；漢族。

所有健康對照選取自同一時期本院職工和大學生志愿者150名，其中男75名，女75名；平均年齡(32±12)歲。同樣由參與者或其監護人在知情同意書上簽字，經由專業流行病調查員記載資料。

1.3 方法

1.3.1 DNA采集

含有抗凝劑(EDTA)的采血管抽取5mL靜脈血，保存于-20℃冰箱備用。提取DNA用相應的試劑盒，目的基因位點用PCR擴增，用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳驗證相關的基因型。

1.3.2 引物設計

在www.ncbi.nlm.nih.gov網站上下載5-HTTLPR的基因序列。使用primer 5.0進行引物設計:5-HTTLPR位點上游引物:5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA AC-3'，下游引物:5'-GCA GCA GAC AAC TGT GTT CAT C-3'。

1.3.3 反應體系及擴增條件

優化的PCR反應體系如下：

體系體積10×緩沖液2μL25mmol/L MgCl21.5μL2.5mmol/L dNTP1.6μL10μmol/L 5-HTTLPR上、下游引物1.0μL5U/μL Pfu酶0.5μL100ng/μL DNA 模板1μL補充ddH2O至適當體積體系總體積20μL

優化的PCR反應步驟:預變性(95℃)5 min；35個循環如下：94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 60s；最后72℃延伸10min。把以上PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳，拍照并分析結果。

1.3.4 基因型鑒定

根據電泳結果分析個體的基因型，在2%瓊脂糖凝膠中每孔加入15μL擴增產物，電泳時所用電壓為80V，根據條帶位置終止電泳(美國BIO-RAD電泳儀)。凝膠經核酸染料染色后，在成像儀中觀察并拍照記錄結果。

1.4 統計學方法

整理該研究中的實驗數據，使用SPSS 13.0統計軟件進行相關的數據分析。方法包括頻數分析、Hardy-Weinberg平衡定律(H-W定律)的吻合度檢驗、χ2檢驗等。

2 結 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗

經統計分析，5-HTTLPR位點觀察組(χ2=2.393，P>0.05)，對照組(χ2=0.867，P>0.05)；5-HTTVNTR 位點觀察組(χ2=1.253，P>0.05)，對照組(χ2=0.268，P>0.05)，觀察值與期望值吻合度良好，均符合Hardy-Weinberg定律。說明樣本具有群體代表性，資料可靠。

2.2 5-HTTLPR位點多態性電泳結果

通過設計的相關引物，PCR后電泳檢測到兩個條帶：528bp(Long，L)和485bp(Short，S)，即可分為L/L、L/S和S/S 3種基因型。見圖1。

L/L基因型：1、8、11；L/S基因型：2、3、4、5、6、7、10、12；S/S基因型：9

2.3 5-HTTLPR基因型在觀察組與對照組的情況分析

3組基因型頻率在總體分布上兩組差異無統計學意義(χ2=4.53，P>0.05)。見表1。

表1 5-HTTLPR各等位基因及基因型頻率的分布

2.4 5-HTTLPR基因型在各組中的分布按性別分層后的比較

觀察組和對照組比較，性別基因型分布無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 5-HTTLPR 基因型按性別分層后的分布

3 討 論

5-HT又名血清素(serotonin)，主要是由嗜鉻細胞分泌的色氨酸衍生，作為一種體內非常重要的神經遞質，其主要的生理學功能包括調控痛覺、體溫和睡眠等，其發揮作用的機制是通過與細胞膜上的相應受體結合。1984年Slauson等[5]研究表明5-HT具有調節淋巴細胞免疫抑制功能，并在免疫系統中也有明顯的作用。5-HT與過敏性疾病、腫瘤和精神神經類疾病發生與治療有一定聯系，尤其是神經精神類疾病，它作為免疫調節因子調控機體神經免疫調節網絡，在神經系統中發揮作用。目前發現，其發揮免疫調控作用的機制可能是與免疫細胞表面存在的受體有關，5-HT通過與細胞表面的不同受體結合，發揮相應的免疫調節功能[6]。

5-HTT定位于神經突觸前膜，能夠對存在于突觸間隙的5-HT進行再攝取，從而影響5-HT在突觸間隙的含量，由此調控中樞5-HT系統和外周5-HT效應，而產生相應的生物學效應。5-HT轉運體的蛋白表達受其基因多態性影響，進而導致5-HT的改變。人類5-HT轉運體由單基因編碼(SLC6A4)，該基因定位于17q11.1～17q12區，由14個外顯子構成編碼序列，與5-HT轉運體相關的基因多態性區有3個，其中研究最多的是5-HTTLPR。位于轉錄啟始位點上游的1kb處，包括2種等位基因，兩者相差44個堿基對，插入或缺失形成L型(長)和S型(短)，由此在不同的個體中可能會出現三種基因型:LL型(純合子插入)，LS型(雜合子插入/缺失)，SS(純合子缺失)[7]。不同的基因型會影響5-HT轉運體基因mRNA水平和蛋白表達能力，L等位基因比S等位基因的基礎轉錄效率要高一些，從而引起重攝取5-HT的活力提高。在淋巴母細胞中，Hranilovic等[8]研究發現LL基因型細胞表達5-HT轉運體mRNA水平比含S等位基因的細胞提高約30%左右，同樣的研究被Heils等[7]證實：LL基因型含5-HT轉運體數量比LS或SS基因型多30%～40%，并且重攝取5-HT的量是LS或SS基因型的2倍左右[9]。由此可以推斷有些疾病的發生發展可能和該基因的基因型有關聯，但是我們通過研究發現5-HTTLPR三種基因型在觀察組分布上與正常對照組差異無統計學意義(P>0.05)，同M?ssner的研究一致[10]，同時我們還進行了性別分層后的比較，研究發現男、女銀屑病組和正常組比較，基因型分布無明顯差異(P>0.05)。這些研究表明5-HTTLPR的多態性與銀屑病沒有相關性，它可能通過其他的機制調控疾病的發生。

由此推斷具有不同5-HTTLPR基因型的人可能在5-HT的攝取及對阻斷5-HT攝取藥物的反應有所不同。5-HTT基因型對5-HTT表達的調控作用還影響到人類患焦慮-抑郁譜障礙的易感性及對環境應激的適應性。臨床研究表明，5-HTTLPR的2個等位基因與心境障礙、人格特征、精神分裂癥、物質依賴、廣泛性焦慮障礙等具有相關性或連鎖不平衡，但各研究結果之間有矛盾之處[11-17]。雖然本研究的5-HTT基因型與疾病沒有相關性，但是后續我們還將開展該基因其它位點的多態性與疾病的關聯，以期從遺傳學的角度闡述銀屑病的發病機制。