MiR-520f-3p靶向SOX9抑制結腸癌的惡性進展

許鳴超，侯鵬飛，張令巧

(濮陽市油田總醫院消化內科，河南 濮陽 457001)

結腸癌是世界上第4大常見的癌癥，也是癌癥死亡的第3大原因[1]。盡管隨著結腸鏡的發展和普及，結腸癌的發病率和死亡率有所下降[2]。但是，每年結腸癌的死亡率和死亡人數仍然很高。因此，探究結腸癌發生、發展的分子機制，制定結腸癌的治療策略具有重要意義。

有研究表明miRNA可能作為癌基因或抑癌基因來調節增殖、遷移和侵襲過程中關鍵調控因子的表達進而影響結腸癌的發生、發展[3]。miR-4711-5p通過KLF5、MDM2和TFDP1調控結腸癌細胞的干細胞特性和細胞周期[4]。miR-520f-3p作為miRNA的一種，在多種癌癥中異常表達。例如，膽管癌[5]、膠質母細胞瘤[6]和胃癌[7]等。但是miR-520f-3p影響結腸癌的作用機制仍不完善，需要進一步探索。

轉錄因子SOX9(SRY-related high mobility group-box 9)屬于SOX蛋白家族，包括SOX8、SOX9、SOX10和SOXE[8]。許多研究表明SOX9對多種癌癥的發生發展都有影響，例如SOX9通過Wnt/β-catenin信號通路影響非小細胞肺癌的上皮-間充質轉化[9]；miR-30c通過靶向SOX9阻礙膠質母細胞瘤細胞的增殖和遷移[10]。但是，關于SOX9在結腸癌細胞中的功能鮮有研究。

本次實驗主要研究了miR-520f-3p和SOX9在結腸癌細胞表達情況以及miR-520f-3p與SOX9基因對結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為的調控作用機制，為結腸癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞及儀器

人正常結腸上皮細胞系NCM-460(BNCC339288)和人結腸癌細胞系HCT 116(BNCC337692)、SW480(BNCC100604)、HT-29(BNCC100164)均購自北納生物。

FBS(Gibco，Grand Island，NY，USA)、Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)、TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)、反轉錄試劑盒Revert Aid First Strand(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Vilnius，Lithuania)、QuantiTect SYBR Green PCR Master mix(Takara Bio，Inc.，Otsu，Japan)、BCA定量試劑盒(Thermo fisher，USA)、PVDF膜(Millipore，Billerica，MA，USA)、ECL試劑盒(Solarbio，Beijing，China)、兔抗SOX9(Abcam，UK)、兔抗β-actin(Abcam，UK)，山羊抗兔IgG(Abcam，UK)、CCK8溶液(Dojidon，Japan)、酶標儀(Bio-Rad，USA)、Transwell(BD Biosciences，CA，USA)、pmirGLO熒光素酶報告載體(Promega，WI，USA)、基因檢測試劑盒(Promega，Fitchburg，WI，USA)、GraphPad Prism軟件(GraphPad，USA)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

NCM-460和HT-29在McCoy’s 5A培養基中培養，HCT 116在RPMI-1640培養基中培養，SW480在DMEM高糖培養基中培養。培養基均添加10%的FBS。所有細胞都在CO2濃度為5%、溫度為37℃的培養箱中培養。

1.2.2 細胞轉染

miR-520f-3p模擬物miR-520f-3p mimics和對照模擬物NC mimics以及pcDNA3.1-SOX9載體oe-SOX9和空的pcDNA3.1質粒載體oe-NC均由GenePharma公司(中國上海)合成。根據制造商說明書使用Lipofectamine 2000轉染。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測(qRT-PCR)

謝清森通過主動申請聯系和多方努力，在2014年與英國聯合安保公司成功牽手，共同成立七兵堂國際安保集團(中國)有限公司，這一跨越國界和意識形態的歐亞牽手，標志著七兵堂正式開始涉足國際安保服務領域，歷史性地實現了走出國門、邁向世界的遠大夢想。

采用TRIzol試劑從細胞提取總RNA。使用反轉錄試劑盒Revert Aid First Strand將RNA逆轉錄成cDNA，采用QuantiTect SYBR Green PCR Master mix進行qRT-PCR實驗。SOX9以GAPDH為內參，miR-520f-3p以U6為內參，引物序列如下：miR-520f-3p(forward)：5'-GTGCCTGTTGCGTCTC-3'，(reverse)：5'-GAAAGCCTAGCCGTATTCG-3'；SOX9(forward)：5'-AGGAAGTCGGTGAAGAACGG-3'，(reverse)：5'-CGCCTTGAAGATGGCGTTG-3'；GAPDH(forward)：5'-TGACTTCAA CAGCGACACCCA-3'，(reverse)：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'；U6(forward)：5'-GACCGAGTGTAGCAAGG-3'；(reverse)：5'-GTTCTTCCGAGAACATATAC-3'。結果用2-ΔΔCt值來比較對照組和實驗組miR-520f-3p和SOX9 mRNA相對表達量的差異。

1.2.4 Western blot實驗

使用全蛋白裂解液裂解細胞，BCA定量試劑盒檢測樣品蛋白濃度。取樣品進行10% SDS-PAGE電泳。然后將蛋白樣品轉移到PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶封閉2h。用一抗孵育一晚，二抗孵育1h。最后，用ECL試劑盒檢測蛋白印記并拍照。本研究所用的一抗為：兔抗SOX9、兔抗β-actin，二抗為：山羊抗兔IgG。

1.2.5 細胞增殖實驗

采用CCK8比色法檢測細胞增殖能力。將細胞以每孔5×103個細胞/孔的濃度接種于96孔平板。分別培養24h、48h和72h后，每組選取5個復孔，在孔中加入10μL CCK8溶液孵育1h。最后使用酶標儀檢測細胞在450nm波長下的吸光度。

1.2.6 細胞劃痕實驗

將細胞接種于12孔板(2×105個/孔)中，當細胞融合度達到90%時，采用200μL無菌槍頭人為的輕輕劃擦穿過孔中心的單層。然后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌細胞2次，并在無血清培養基中孵育。分別再培養24h后用顯微鏡觀察并拍攝愈合圖像。

1.2.7 細胞侵襲實驗

在涂有基質膠的Transwell上室中接種約2×104個細胞，在下室中加入600μL含有10% FBS的DMEM培養基。培養48h后用4%甲醛溶液進行固定，用0.1%的結晶紫染色。選取5個視野，通過顯微鏡觀察細胞的侵襲情況并拍照。

1.2.8 雙熒光素酶實驗

構建了插入SOX9野生型(wt)和突變型(mut)3' UTR的pmirGLO熒光素酶報告載體。將HCT 116細胞接種在48孔板中并培養24h，將miR-520f-3p mimics/NC-mimics和pmirGLO wt/mut質粒共轉染到細胞中，48h后收集細胞。然后，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒進行檢測。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 miR-520f-3p在結腸癌細胞中低表達

qRT-PCR實驗結果顯示，與正常結腸上皮細胞系NCM-460相比，結腸癌細胞系HCT 116、SW 480、HT-29中miR-520f-3p表達顯著下調(圖1)。

(與NCM-460相比，*P<0.05，n=3)

2.2 過表達miR-520f-3p抑制結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲

qRT-PCR實驗結果顯示，過表達組的miR-520f-3p表達量顯著高于對照組(圖2A，封三)，可以用于接下來的實驗。隨后，CCK8實驗發現過表達miR-520f-3p的結腸癌細胞相較于對照組增殖能力明顯降低(圖2B，封三)。細胞劃痕實驗結果顯示，在HCT 116細胞中，過表達miR-520f-3p顯著抑制了細胞的遷移(圖2C，封三)。Transwell實驗結果顯示轉染miR-520f-3p mimic的HCT 116細胞侵襲能力低于對照組(圖2D，封三)。這些結果表明，過表達miR-520f-3p可以抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

2.3 miR-520f-3p靶向下調SOX9

qRT-PCR和Western blot檢測人正常結腸上皮細胞系和人結腸癌細胞系中SOX9 mRNA和蛋白的表達，結果顯示SOX9 mRNA和蛋白在結腸癌細胞系中表達上調(圖3A～3B)。Targetscan預測得到SOX9和miR-520f-3p之間存在靶向結合位點(圖3C)。雙熒光素酶實驗進行驗證，結果發現miR-141-3p過表達會顯著降低SOX9-wt熒光素酶活性，而對SOX9-mut熒光酶素活性無明顯影響(圖3D)。qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，過表達miR-520f-3p后，SOX9的表達水平顯著下調(圖3E～3F)。這些實驗結果證明了miR-520f-3p在結腸癌細胞中靶向調控SOX9。

2.4 miR-520f-3p靶向下調SOX9抑制結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲

qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示過表達處理SOX9后，SOX9 mRNA和蛋白表達水平均顯著上調；而同時過表達miR-520f-3p后，SOX9的表達水平明顯下降(圖3A～B，封三)。CCK8、細胞劃痕實驗和Transwell實驗，結果表明當SOX9表達上調時，結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著增強，然而，同時過表達miR-520f-3p后細胞的增殖、遷移和侵襲能力降低(圖4C～E，封三)。這些實驗結果證明了miR-520f-3p是通過調控SOX9抑制了結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

3 討 論

結腸癌是全球癌癥相關死亡的主要原因[1]。盡管治療手段不斷發展，結腸癌的五年生存率仍不令人滿意[2]。因此，十分有必要探究結腸癌發生發展的機制，尋找更好的治療方法。在過去的研究中，miRNA被發現在許多類型的人類癌癥中調控癌細胞的生物學功能，這可以作為治療靶標[11]。對于結腸癌，人們發現miR-378通過抑制SDAD1抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[12]；miR-219a-1通過靶向MEMO1抑制結腸癌細胞增殖和侵襲[13]，可見miRNA是結腸癌潛在生物標志物的來源之一。目前為止，miR-520f已被發現在NSCLC中發揮腫瘤抑制因子的作用，circ-0043278通過直接抑制miR-520f來增加ROCK1、CDKN1B和AKT3的表達，從而促進NSCLC細胞的增殖、侵襲和遷移[14]；另外，miR-520f被發現在人HCC組織和細胞系中顯著下調。而且，miR-520f的表達異常與HCC患者的較大腫瘤、晚期TNM分期和轉移密切相關。但是，miR-520f-3p在結腸癌細胞系中的表達模式和作用仍然未知。在本次研究中發現，相比于人正常結腸上皮細胞，miR-520f-3p在結腸癌細胞系中均顯著低表達，這與其在其它疾病中的結果一致。

在本研究中，通過構建過表達miR-520f-3p的結腸癌細胞，以及細胞功能實驗，發現過表達miR-520f-3p可以抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。這些實驗結果表明，miR-520f-3p是結腸癌進展中的腫瘤抑制因子。與本研究結果一致，先前的研究發現miR-520f抑制肝癌細胞的增殖和侵襲[15]，下調miR-520f的表達水平會導致胃癌細胞增殖能力增強[16]。

已知miRNA通過靶mRNA3'-UTR結合來控制基因表達。為了評估miR-520f-3p如何影響結腸癌，本研究在結腸癌細胞系中鑒定其靶基因。以往有研究表明，miR-520f-3p在SOX9在結腸癌的進展中發揮了關鍵作用[17]。SOX9是一種特殊的轉錄因子，它在調節軟骨形成、性腺和胰腺形成等多種發育途徑中發揮重要作用[18]。多種miRNA已顯示靶向SOX9，據報道，miRNA-105通過直接靶向SOX9抑制胃癌的進展[19]；Sang等研究報道miR-613在膠質瘤細胞中靶向SOX9抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[20]。本研究發現SOX9在結腸癌細胞系中表達上調，在結腸癌細胞中miR-520f-3p能夠調控SOX9的表達水平，并且雙熒光素酶實驗證實了兩者之間的靶向關系。進一步的研究發現，過表達miR-520f-3p能夠回復上調SOX9對結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲過程的促進作用。這些結果表明，miR-520f-3p通過調控SOX9進而抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。因此，調節miR-520f-3p/SOX9途徑的靶向療法可能會成為改善結腸癌患者生存率的新機會。

總而言之，本研究證明了在結腸癌中miR-520f-3p低表達，發揮抑癌作用，上調miR-520f-3p能夠抑制SOX9的表達進而抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學功能；同時也揭示了miR-520f-3p在結腸癌惡性進程中的調控機制。這些發現為miR-520f-3p作為結腸癌的靶向化療藥物提供了實驗基礎，為靶向治療結腸癌提供新思路，從而促進新型抗癌藥物的開發。