沉默C/EBP β抑制肺腺癌A549的惡性生物學行為

王健鍵，康 凱，易勝中

(湖北省腫瘤醫院胸外科，湖北 武漢 430071)

CCAAT/增強子結合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein β，C/EBP β)是CCAAT/增強子結合蛋白家族中非常重要轉錄因子，具有普遍生物學功能，可以調節細胞增殖、分化，并參與侵襲、增殖和凋亡等細胞分子生命活動，進而影響腫瘤的發生、發展進程[1]。

肺癌已成為發病率和死亡率居首位的癌癥，而肺腺癌(lung adenocarcinoma cancer，LAC)是非小細胞肺癌中最常見的病理類型[2]，具有早期癥狀不典型、發病隱匿、進展迅速的特點，大多數確診時都為晚期，導致此病的預后、生存率偏低。從分子水平研究肺腺癌的發病機制具有重要意義，隨著醫學的進步，從分子水平介入，又能為提高肺腺癌診療提供很好的思路[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

肺腺癌A549細胞株自購于中國科學院(上海)細胞庫。胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培養基購自Hyclone公司。轉染試劑lipofectamine2000購自Invitrogen公司。Transwell小室購于美國Corning公司。Matrigel基質膠為BD公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

將肺腺癌A549細胞株放置在37℃，體積分數為5%CO2的細胞培養箱中常規培養。培養液選用含10%FBS和100×雙抗的DMEM高糖培養基。

1.2.2 細胞轉染與分組

當肺腺癌A549細胞匯合度達到50%左右時，開始進行siRNA轉染。將C/EBP β siRNA、siRNA control按lipofectamine 2000轉染試劑說明書操作。轉染后收集細胞用于后續實驗。Western blot檢測C/EBP β的沉默效率。轉染C/EBP β siRNA的肺腺癌A549細胞記為C/EBP β-siRNA組，轉染siRNA control后的肺腺癌A549細胞記control-siRNA組[4-5]。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖活性

收集對數生長期的C/EBP β siRNA干擾細胞、siRNA control細胞，調整細胞濃度為1×106個/mL后，接種在96孔板中，每組設置6個復孔，常規培養后分別于24h、48h、72h后取樣。每孔加入20μL濃度為5mg/mL的MTT，37℃培養4h后，再加入150μL的二甲基亞砜。低速震蕩至溶解，在波長570nm下用酶標儀測定吸光度(OD值)，重復實驗6次，計算各組細胞增殖抑制率，結果以(均數±標準差)表示[6-7]。

1.2.4 平板克隆形成實驗

選取對數生長期的C/EBP β siRNA細胞和control siRNA細胞，消化離心，除去上清液，再用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次。取1000個細胞接種在6孔培養板中，每組設置3個重復孔，常規培養7d后終止培養。收板，用95%的乙醇固定后，再用0.1%的結晶紫染色，然后在顯微鏡下計算陽性克隆數(大于50個細胞的克隆被認定為陽性克隆)。計算克隆形成率(%)=陽性克隆形成數/接種細胞總數×100%[8-9]。

1.2.5 Transwell檢測遷移能力

在Transwell下室加入含 20% FBS的培養基650μL，Transwell上室加入細胞懸液100μL，細胞含量約為2×105個，放置在細胞培養箱中培養48h。將Transwell小室放置在4%多聚甲醛溶液中，室溫下固定20min后，用0.1%的結晶紫染色10min，再用棉簽輕擦去小室內的細胞，PBS液清洗3次，每次洗5min左右。然后將小室風干，在顯微鏡下取6個視野并記錄每個視野下的細胞數量，取平均值，結果用(均數±標準差)表示。

1.2.6 Transwell檢測侵襲能力

先將matrigel基質膠從-20℃冰箱中取出，放在4℃冰箱中冷藏解凍，按照1∶8的比例用無血清培養基稀釋matrigel基質膠。在每個小室加入稀釋后基質膠45μL，在37℃的細胞培養箱中放置30min，待基質膠凝固后，再按照遷移能力的步驟開展后續實驗，記錄并計算細胞數量，所得數據即為細胞侵襲數。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 MTT法檢測細胞增殖能力

用MTT法檢測肺腺癌A549細胞增殖能力，作用72h后，C/EBP β-siRNA組抑制肺腺癌A549細胞增殖能力較control-siRNA組有顯著性差異(P<0.01)，結果見圖1。

圖1 C/EBP β-siRNA抑制A549的增殖能力(n=3)

2.2 沉默C/EBP β抑制A549細胞平板克隆形成能力

在平板克隆形成實驗中，與control-siRNA組相比，C/EBP β-siRNA組細胞克隆形成率顯著降低(P<0.01)，結果見圖2。

圖2 沉默C/EBP β抑制A549平板克隆形成能力(n=3)

2.3 沉默C/EBP β對肺腺癌A549細胞遷移能力的影響

Transwell小室實驗結果見圖3(封三)，兩組數據差異有顯著性統計學意義(P<0.01)。由此可見，沉默C/EBP β-siRNA組細胞遷移能力明顯弱于control-siRNA組。

2.4 沉默C/EBP β對肺腺癌 A549 細胞侵襲能力的影響

Transwell小室實驗結果見圖4(封三)，兩組數據差異有顯著性統計學意義(P<0.01)。由此可見，沉默C/EBP β-siRNA組細胞侵襲能力明顯弱于control-siRNA組(P<0.01)。

3 討 論

肺腺癌是非小細胞肺癌中占比較多的病理類型，患病率較高，且容易發生轉移、局部浸潤，臨床以手術、放療、化療為主要治療方法。目前對肺腺癌的發病機制尚不完全清楚，在早期存在一定的隱匿性，缺少具有特異性、敏感性的診斷指標，同時早期肺腺癌無特異性癥狀，患者很容易錯過最佳治療時機，在確診時往往已到晚期[10]，5年總生存率僅有不到20%[11]。隨著精準醫療的不斷發展，選擇可靠的分子靶點，從分子層面研究肺腺癌進展機制，盡可能在早期抑制肺腺癌的增殖、侵襲、轉移，對臨床早期診斷、治療肺腺癌提供有效的方法有著重要的臨床意義。

腫瘤細胞具有較強的增殖能力，且增殖速度遠遠超過正常細胞。MTT法通過活細胞染色及個性化篩選可以檢測細胞生長和存活，有效檢測化療藥物對腫瘤細胞的敏感性，且檢測結果與臨床療效相吻合。利用MTT檢測肺腺癌A549細胞增殖能力可以為臨床判斷肺腺癌預后及藥物反應提供一定的數據支撐[12]。單個細胞通過有絲分裂形成的細胞群體即為細胞克隆，克隆形成的大小和多少在一定程度上反映了腫瘤細胞的增殖能力[6]。腫瘤死亡率高的主要原因包括腫瘤細胞的轉移，而腫瘤細胞的遷移、侵襲又是發生轉移的前提，同時也受多種調控機制影響[3]。

C/EBP β是堿性亮氨酸拉鏈結構轉錄因子，具有普遍生物學功能，參與細胞侵襲、增殖、凋亡等細胞分子事件，可影響腫瘤的發生、發展進程[1]。越來越多的研究證實C/EBP β在惡性腫瘤生物學行為中起致瘤性作用，但是在肺癌，尤其是肺腺癌中的作用還未完全闡明。

C/EBP β的表達失調與腫瘤惡化程度密切相關[1]。本研究通過細胞實驗分析C/EBP β對肺腺癌 A549細胞增殖、平板克隆形成、遷移、侵襲的影響，不難發現，沉默C/EBP β對肺腺癌A549細胞有明顯的抑制作用，我們的研究結果提示C/EBP β可輔助診斷早期肺腺癌，并可作為肺腺癌患者的預后評價指標，為臨床肺腺癌診治、預后提供參考，但具體作用機制有待進一步探索。