青磚茶多糖含量測定條件的響應面法優化研究

王世越，王自瑤，柯欽豪，謝文靜，周宏福，王 彩，鄭 敏

(湖北科技學院，湖北 咸寧 437100)

青磚茶屬黑茶系，主產于鄂南地區，湖北省咸寧市是其主產區之一，現已有六百多年的生產歷史[1]。傳統的青磚茶使用老青茶為原料，經相應的制作工藝流程處理后，得到的青磚茶外表色澤青褐，其茶湯色澤明亮偏紅，味道醇厚。目前已有研究發現青磚茶具有一些保健功效，如：減肥降脂[2-3]、改善胃腸道功能[4-5]、抗氧化[6-7]及抑菌[8]等功能。青磚茶多糖為青磚茶中主要的功能成分之一，具有抗氧化性[9]、抑制α-葡萄糖苷酶活性[10]等功能。因此，青磚茶多糖中糖含量的準確測定對青磚茶多糖今后的研究具有重要的影響。

多糖是一類廣泛存在于自然界的天然大分子物質[11]，常用的多糖含量檢測方法有苯酚濃硫酸法、蒽酮硫酸法、高錳酸鉀滴定法等[12]。苯酚濃硫酸法因操作簡單且靈敏的優點被廣泛應用，其原理是通過強酸加高溫的條件下將多糖水解為單糖，單糖在該環境下迅速脫水生成糖醛衍生物，進一步與苯酚結合，生成顯色物質，通過紫外分光光度計對其進行檢測，在490nm波長附近具有最大吸收峰[13]。

通過苯酚濃硫酸法進行多糖含量測定時，測定結果受多糖組成、濃硫酸用量以及苯酚用量的影響[14]。所以，為使測定結果更為準確，需對該方法進行條件優化。本實驗以青磚茶為原材料，使用苯酚濃硫酸法測定青磚茶多糖的含量，確定其最大吸收波長，優化靜置時間、水浴時間、水浴溫度、苯酚用量、濃硫酸用量5個影響因素，并進一步采用響應面法進行優化。對優化后方法進行精密度、穩定性、重復性以及加樣回收率等進行考察，旨在建立青磚茶多糖含量的最佳測定方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

青磚茶(湖北赤壁趙李橋茶業有限公司)、濃硫酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)、苯酚(分析純，天津市天力化學試劑有限公司)、葡萄糖(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)、石油醚(分析純，麥克林試劑有限公司)、乙醇(95%，麥克林試劑有限公司)、聚酰胺粉(分析純，阿拉丁試劑有限公司)。

紫外分光光度計(A360型，翱藝儀器有限公司)、水浴鍋(HH-S型，常州市瑞華儀器制造公司)、高速離心機(TGL-20M型，湖南滬康離心機有限公司)、集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S型，上海辰邦西儀器科技有限公司)、真空干燥箱(DZ-1BC1V型，天津泰斯特儀器有限公司)、旋轉蒸發儀(N-1300型，EYELA有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液的配制

準確稱量青磚茶粉末(過80目篩)20g，放置于三頸燒瓶中，按料液比1∶10加入石油醚，60℃下加熱3h除色素，取茶渣60℃下干燥至恒重。將茶渣放置于三頸燒瓶中，按料液比1∶10加入80%的乙醇溶液，80℃下加熱2h除小分子，取茶渣80℃下干燥至恒重。取茶渣按料液比1∶16加入超純水，60℃下水提4h，將水提液在5 000r/min下離心15min，重復兩次，取其上清液。將上清液旋蒸濃縮至20mL，加入60mL無水乙醇，4℃過夜，8 000r/min下離心15min，取沉淀，冷凍干燥，得青磚茶初多糖。取1.0g青磚茶初多糖，配制為10mg/mL的多糖溶液，過聚酰胺柱除蛋白質與色素，收集洗脫液，濃縮后透析48h，冷凍干燥得精制青磚茶多糖[15-17]。取0.1g精制青磚茶多糖，加入定容于100mL的容量瓶中，搖勻得樣品溶液。

1.2.2 對照品溶液的配制

精密稱量D-葡萄糖0.100 0g，加水定容于100mL的容量瓶中，搖勻得對照品溶液。

1.2.3 最大吸收波長的確定

吸取1.2.1步驟中樣品溶液0.8mL，置于離心管中，加入5%苯酚0.8mL、濃硫酸4mL，室溫下避光靜置10min，30℃下水浴加熱25min。以純水為空白對照，重復以上步驟，在紫外分光光度計下400～600nm波長段掃描波長圖譜。

1.2.4 顯色條件的優化

(1)苯酚用量。精密移取青磚茶多糖溶液0.8mL于10mL的具塞試管中，分別加入5%的苯酚溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，混勻后加入濃硫酸4mL，搖勻后在30℃下水浴25min，取出后待其冷卻至室溫，測定吸光度。每組以純水為空白對照，加入不同量的苯酚溶液，重復上述流程。重復實驗3次。

(2)濃硫酸用量。精密移取青磚茶多糖溶液0.8mL于10mL的具塞試管中，分別加入5%的苯酚溶液0.8mL，混勻后分別加入濃硫酸3、4、5、6、7mL，搖勻后在30℃下水浴25min，取出后待其冷卻至室溫，測定吸光度。每組以純水為空白對照，加入不同量的濃硫酸溶液，重復上述流程。重復實驗3次。

(3)靜置時間。精密移取青磚茶多糖溶液0.8mL于10mL的具塞試管中，加入5%苯酚溶液0.8mL，混勻后加入濃硫酸4mL，靜置10、20、30、40、50min，每組以純水為空白對照，靜置不同時間，測定吸光度。重復實驗3次。

(4)水浴溫度。精密移取青磚茶多糖溶液0.8mL于10mL的具塞試管中，加入5%苯酚溶液0.8mL，混勻后加入濃硫酸4mL，分別在30、40、50、60、70、80℃下水浴25min，每組以純水為空白對照，不同溫度下進行水浴，測定吸光度。重復實驗3次。

(5)水浴時間。精密移取青磚茶多糖溶液0.8mL于10mL的具塞試管中，加入5%苯酚溶液0.8mL，混勻后加入濃硫酸4mL，在30℃下分別水浴15、25、35、45、55min，每組以純水為空白對照，水浴加熱相應的時間，測定吸光度。重復實驗3次。

1.2.5 苯酚濃硫酸法響應面實驗

在單因素實驗的基礎上選擇對吸光度結果影響較大的條件：苯酚用量、濃硫酸用量、水浴溫度3個因素為自變量。使用軟件Design-expert 8.0.6進行Box-Behnken實驗設計，對苯酚濃硫酸法測定青磚茶多糖含量進行條件優化。實驗設計因素、水平如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗因素與水平表

1.3 方法學驗證

1.3.1 標準曲線的繪制

精密移取不同濃度的對照品溶液各0.8mL于10mL具塞試管中，按優化后的條件進行顯色操作，測定最大吸收波長處的吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 重復性考察

精密移取5份多糖溶液0.8mL于10mL具塞試管中，按優化后的條件進行顯色操作，測定最大吸收波長處的吸光度，求RSD值。

1.3.3 精密度考察

精密移取多糖溶液0.8mL于10mL具塞試管中，按優化后的條件進行顯色操作，在最大吸收波長處連續測定5次，求RSD值。

1.3.4 穩定性考察

取1.3.3中溶液，在放置5、15、25、35、45min后，在最大吸收波長處進行吸光度測定，求RSD值。

1.3.5 加樣回收率實驗

精密吸取4份青磚茶多糖溶液0.8mL，一份做為對照品，另外3份加入不同重量的葡萄糖，按照優化后的方法優化以上溶液，測試最大波長處吸光度。吸取0.8mL純水，按優化后方法進行顯色操作，作為空白對照。

1.4 數據處理

本試驗采用origin軟件進行數據的處理及繪圖。

2 結 果

2.1 最大吸收波長

青磚茶多糖400～600nm波長掃描圖見圖1?？芍啻u茶多糖紫外最大吸收峰在487nm處。

圖1 青磚茶多糖紫外吸收光譜

2.2 顯色條件的優化

2.2.1 苯酚用量

苯酚用量與吸光度的關系，見圖2。實驗結果顯示：當加入5%苯酚量0.4～0.6mL，吸光度隨苯酚的量增加而增加；當苯酚量大于0.6mL，吸光度下降。說明苯酚在合適的用量下可達到最佳的顯色效果，根據實驗結果選擇0.6mL的苯酚作為顯色條件。

圖2 不同苯酚量下的吸光度(n=3)

2.2.2 濃硫酸用量

濃硫酸用量與吸光度的關系，見圖3。實驗結果顯示：當加入濃硫酸3～5mL，吸光度隨苯酚的量增加而增加；當濃硫酸量大于5mL，吸光度下降。說明濃硫酸在合適的用量下可達到最佳的顯色效果，根據實驗結果選擇5mL的濃硫酸作為顯色條件。

圖3 不同濃硫酸量下的吸光度(n=3)

2.2.3 靜置時間

靜置時間與吸光度關系，見圖4。實驗結果顯示：靜置10～30min，吸光度隨時間的增加而上升，30min后，吸光度趨于穩定。因此，選擇30min作為最佳的靜置時間。

圖4 不同靜置時間下的吸光度(n=3)

2.2.4 水浴溫度

水浴溫度與吸光度的關系，見圖5。實驗結果顯示：水浴溫度30℃～60℃，吸光度隨溫度的增加而上升；當溫度大于60℃，吸光度開始下降，推測是過高的溫度導致顯色物質分解。因此，選擇60℃作為最佳顯色溫度。

圖5 不同水浴溫度下的吸光度(n=3)

2.2.5 水浴時間

不同水浴時間下的吸光度，見圖6。實驗結果顯示：水浴15～25min，吸光度隨水浴時間的增加而升高，溫度大于25min后，吸光度下降，推測是由于水浴時間過長導致顯色物質分解。根據實驗結果選擇25min作為水浴時間。

圖6 不同水浴時間下的吸光度(n=3)

2.3 響應面實驗結果

2.3.1 響應面實驗設計及結果

使用軟件Design-expert 8.0.6進行Box-Behnken實驗設計，實驗結果見表2。

表2 Box-Behnken設計實驗結果

2.3.2 響應面實驗模型及方差分析

運用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行擬合分析，得回歸方程模型：y=3.14+0.028A+0.062B-0.007 125C+0.032AB+0.076AC-0.042C-0.089A2-0.100B2-0.056C2。見表3。

表3 響應面實驗模型方差分析

響應面圖中圖像陡峭程度代表影響程度，越陡峭代表影響越高。繪制不同因素之間的交互作用圖，如圖7(封二)所示。

結合實驗方差結果與響應面圖分析，可得出三個因素的影響大小分別為：濃硫酸用量>苯酚用量>水浴溫度。

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，得到苯酚-硫酸法測定青磚茶多糖含量的最佳條件為：苯酚用量0.62mL，濃硫酸用量5.36mL，水浴溫度59.32℃，在此條件下預測吸光度為3.153 65?？紤]到實際操作因素，將最佳條件調整為：苯酚用量0.6mL，濃硫酸用量5mL，水浴溫度60℃。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線的繪制

葡萄糖標準曲線如圖8，葡萄糖標準溶液與吸光度之間的線性回歸方程為y=5.923 7X+0.063 9，R2=0.996 7，說明該方法下葡萄糖在濃度0.1～0.5mg/mL下呈現良好的線性關系。

圖8 葡萄糖標準曲線

2.4.2 重復性考察

由表4顯示，通過5次重復性實驗，相對標準偏差RSD為1.07%，表明該方法重現性好。

表4 重復性實驗

2.4.3 精密度考察

由表5顯示，通過5次精密度實驗，相對標準偏差RSD為0%，表明該方法精密度好。

表5 精密度實驗

2.4.4 穩定性實驗

由表6顯示，通過5次穩定性實驗，相對標準偏差RSD為0.15%，表明該方法穩定性好。

表6 穩定性實驗

2.4.5 加樣回收率

表7顯示，該方法加樣回收率97.22%～99.22%，相對標準差RSD為0.87%，說明該方法具有良好的回收率，且較為穩定。

表7 加樣回收率

3 結 論

通過控制變量法分析了苯酚濃硫酸法中各個因素對測定青磚茶多糖吸光度的影響，得到了測定青磚茶多糖含量的最佳單因素條件，通過響應面法進一步優化，得到最佳的測定條件。實驗結果顯示：最佳測定條件為在0.8mL的多糖溶液中加入0.6mL的5%苯酚溶液，勻速緩慢加入5mL濃硫酸溶液，靜置30min后，在60℃的溫度下水浴25min，冷卻后在487nm處測定其吸光度。該方法在0.1～0.5mg/mL具有良好的線性關系，重復性、穩定性好，精密度高，且回收率良好，可將該方法作為青磚茶多糖測定的最佳方法。