香青蘭總黃酮對T2DM大鼠胰島功能的影響及作用機制研究

許月嬌

(鄭州二砂醫院中西醫結合內科，河南 鄭州 450000)

糖尿病作為臨床高發病種，其中以2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)發病人群最多，主要以慢性高血糖為特征，患者可出現胰腺β細胞功能障礙和外周組織胰島素抵抗(insulin resistance，IR)[1]。2011年，有研究者在“Nature”發表文章，證實T2DM是一種以胰島素抵抗為主要特征的慢性炎癥性疾病，降低機體炎癥反應對T2DM患者糖代謝紊亂具有重要意義[2]。炎癥因子對細胞膜上的葡萄糖轉運蛋白具有抑制作用，抑制胰島素信號傳導，使血清中葡萄糖含量升高，引發胰島素抵抗[3]。現代醫學對糖尿病治療主要通過口服降糖藥物配合胰島素注射，但長期使用西藥會出現高胰島素血癥、藥物易失效等問題[4]。近年來，眾多研究者通過中藥、中藥單體、中藥復方研究展開糖尿病實驗研究，取得不錯的成就。中醫藥注重整體觀念，辨證施治的思維，全面把控疾病，且不良反應較輕，這對糖尿病及其并發癥的治療具有西醫不可取代的優勢[5]。中藥香青蘭(Dracocephalum Moldavica L.)隸屬唇形科植物，具利尿止咳、補益心腦、活血化痰、止痛解毒之功，目前臨床主要用于冠心病、動脈硬化、高血壓、心肌缺血、心絞痛等疾病的治療，化學成分較多，主要包括甾體類與三萜類、揮發油類、蛋白質類、黃酮類、苯丙素類等成分[6-7]。香青蘭中黃酮類化合物近年來因作用廣泛被眾多研究者關注。康小龍等[8]通過實驗研究發現，香青蘭總黃酮可抑制哮喘CRP、LTB4、LTC4、TNF-α、IL-6、IL-13和IL-17等炎癥因子的釋放，在抗炎方面具有顯著藥效。本次研究通過建立T2DM模型，基于炎癥反應觀察香青蘭總黃酮對T2DM大鼠胰島功能影響及作用機制研究，為香青蘭的開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

血糖儀(強生穩捷)；高速冷凍離心機(型號：H1650R，湖南湘儀)；全自動酶標儀(型號：DY001292，蘇州吉諾瑞生物科技有限公司)；電子秤(型號：BT457A，深圳市博途電子科技有限公司)；生物顯微鏡(型號：S800T-T310，蘇州倍特嘉光電科技有限公司)。

1.2 藥品與試劑

香青蘭總黃酮(寶雞晨光生物科技有限公司，每100g香青蘭藥材含香青蘭總黃酮52.35g)；鹽酸二甲雙胍(中美上海施貴寶制，批號：20190622，規格：0.5g)；鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司，批號：S0130，規格：100 mg)；檸檬酸鈉、檸檬酸(成都市恒億化工產品有限公司，批號分別為20190613、20190325)；胰島素(INS，批號：E20191023A)、胰島素抗體(IAA，批號：E20190915A)、腫瘤壞死因子(TNF-α，批號：E20190925A)、白介素-1β(IL-1β，批號：E20191017A)、白細胞介素-6(IL-6，批號：E20191005A)、白介素-18(IL-18，批號：E20191013A)、C-反應蛋白(CRP，批號：E20191011A)、瘦素(LP，批號：E20191019A)、脂聯素(ADPN，批號：E20190928A)、高遷移率族蛋白1(HMGB1，批號：E20190907A)試劑盒均購自蘇州卡爾文生物科技有限公司；蘇木素-伊紅(HE)染色液(北京索萊寶科技有限公司，批號：G112)。

1.3 動物

動物級別：SPF級；品系：SD大鼠；數量：75只；性別：雄性；周齡：7～8周齡；體質量：220～240g，供應單位：濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，生產許可證號：SCXK(魯)20190003。高脂高糖飼料(1.5%膽固醇、10%豬油、0.25%膽酸鈉、5%蔗糖、83.25%普通飼料，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司)。

1.4 方法

動物置適應性喂養7d，飼養室溫度控制在25℃，濕度45%～75%。隨機選取12只為空白組，采用普通飼料正常飼養，剩余動物采用高脂飼料連續喂養4周，一次性舌下靜脈注射STZ 60mg/kg(注射劑量根據前期預實驗成模率進行確定)，7d后血糖儀測定造模動物空腹動態血糖值，取血糖值在16.7～24.00mmol/L范圍內且具有明顯多飲、多食、多尿癥狀大鼠52只為成模動物，隨機分為模型組、鹽酸二甲雙胍組、香青蘭總黃酮高劑量組、香青蘭總黃酮低劑量組，每組12只(實驗過程中，低劑量組及鹽酸二甲雙胍組均死亡1只，為保證結果平行，最終實驗結果以每組10只進行檢測統計)，各組動物分別給予相應藥物灌胃，鹽酸二甲雙胍組(167mg/kg)，香青蘭總黃酮高劑量組(200mg/kg)，香青蘭總黃酮低劑量組(100mg/kg)給藥劑量參照文獻[9]，各組動物給藥體積為2mL/100g，1次/d，連續給藥6周。為保證實驗平行性，空白組和模型組需灌胃同等體積生理鹽水。

1.5 指標監測

1.5.1 動態血糖檢測

分別于第2、4、6周檢測各組動物空腹血糖值。

1.5.2 血清指標檢測

各組動物末次給藥2h后，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，腹主動脈插管收集血清，3 500r/min，15min離心，檢測INS、IAA、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、LP、ADPN、HMGB1含量。

1.5.3 病理指標檢測

摘取胰腺置10%甲醛溶液中固定48h以上，脫水，石蠟包埋，切片(厚度4～6μm)，進行HE染色，置于光學顯微鏡下觀察各組動物胰腺病理變化。

1.6 統計學方法

2 結 果

2.1 各組空腹動態血糖值比較

與空白組比較，模型組動物空腹血糖值自建模后至第6周均異常升高，具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸二甲雙胍組及香青蘭總黃酮高劑量組自建模第2周起空腹血糖值均呈現不同程度降低趨勢，具有統計學意義(P<0.05)，香青蘭總黃酮低劑量組自建模第4周起動態血糖值不同程度降低，具有統計學意義(P<0.05)，結果見表1。

表1 對T2DM大鼠模型空腹動態血糖值影響

2.2 各組大鼠血清INS、IAA含量比較

與空白組比較，模型組大鼠血清INS含量顯著降低，IAA含量顯著升高，具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸二甲雙胍組及香青蘭總黃酮高劑量組均可顯著提升大鼠血清INS水平，降低IAA含量，具有統計學意義(P<0.01)，香青蘭總黃酮低劑量組也可明顯提升大鼠血清INS水平，降低IAA含量，具有統計學意義(P<0.05)，結果見表2。

表2 對T2DM大鼠模型血清INS、IAA含量影響

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量比較

與空白組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量顯著升高，具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸二甲雙胍組及香青蘭總黃酮高劑量組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量降低，具有統計學意義(P<0.01)，香青蘭總黃酮低劑量組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量也不同程度降低，具有統計學意義(P<0.01)，結果見表3。

表3 對T2DM模型大鼠血清TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量影響

2.4 大鼠血清LP、ADPN、HMGB1含量比較

與空白組相比，模型組大鼠血清中LP、HMGB1含量顯著升高，ADPN含量顯著降低，具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸二甲雙胍組及香青蘭總黃酮高劑量組可顯著降低模型動物血清中LP、HMGB1含量，升高ADPN含量，具有統計學意義(P<0.01)，香青蘭總黃酮低劑量組也可不同程度降低動物血清LP、HMGB1含量，升高ADPN含量，具有統計學意義(P<0.01)。結果見表4。

表4 對T2DM模型大鼠血清LP、ADPN、HMGB1含量影響

2.5 大鼠胰腺組織影響

空白組胰島邊界清晰，細胞排列緊密，細胞核松散，胰島細胞漿豐富；模型組胰島皺縮，邊界不清，細胞排列稍紊亂，胰島細胞漿不豐富；鹽酸二甲雙胍組胰島邊界清晰，偶見界欠清胰島，偶見胰島中有空泡，胰島細胞漿較豐富；香青蘭總黃酮高劑量組胰島細胞邊界清晰，細胞排列緊密，偶見胰島中有空泡，胰島胞漿較豐富；香青蘭總黃酮低劑量組胰島細胞邊界欠清晰，胰島中有空泡，胞漿稍欠豐富。各組大鼠胰腺組織鏡下觀察見圖1～5(封二)。

3 討 論

本次研究是基于炎癥反應基礎上對T2DM模型進行藥效學研究，通過模型組血糖水平及血清胰島素水平可知模型復制成功。臨床研究顯示，T2DM患者多伴隨機體內部炎癥反應高于正常值，相關炎癥指標異常升高，TNF-α是機體主要的促炎細胞因子，參與正常炎癥反應和免疫反應。研究[10]顯示TNF-α可抑制葡萄糖載體4(GLUT4)及胰島素底物1(IRS1)的表達，抑制IRS-1酪氨酸磷酸化，而使得IRS-1絲氨酸磷酸化增強，阻斷胰島素信號傳導功能。

CRP是一種極性反應蛋白，由肝臟分泌，血清中CRP濃度與T2DM的發生發展呈正相關性。目前，血清CRP已成為臨床最顯著炎癥標志物之一，成為T2DM的重要預測因子。而IL-6、IL-1β及TNF的轉錄可調控CRP的表達。正常情況下，胰島素可抑制CRP釋放，當機體呈現胰島素抵抗時，CRP被抑制作用逐漸減弱，導致體內CRP水平升高，直接參與全身炎癥反應，加劇IR及2型糖尿病的發展。IL-18作為一種促炎癥細胞因子，與糖尿病多種并發癥尤其是糖尿病腎病的發生密切相關，IL-18分泌的增加可誘導細胞凋亡，嚴重損傷腎小球，促進前列腺素釋放，降低腎小球濾過作用，使蛋白漏出增多[10-11]。本研究顯示，模型動物血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP含量均顯著高于空白組，經香青蘭總黃酮干預后以上指標均有不同程度降低，可知香青蘭總黃酮可有效降低T2DM大鼠血清中炎癥因子水平，降低炎癥反應發生。

LP是一種特異性炎癥因子，由脂肪組織分泌，與胰島素的產生有著極大的關聯，在胰島素抵抗等病理情況下，瘦素增多則會造成脂肪組織胰島素抵抗，即脂肪合成減少，分解增加，產生大量的游離脂肪酸而引起胰島素抵抗[12]。ADPN是由脂肪細胞分泌的生物活性多肽，是胰島素的增敏劑，在低血糖狀態下可對胰島素的分泌產生抑制作用；相反，當機體處于高血糖狀態時，可促進胰島細胞分泌胰島素，用于衡量胰島β細胞的功能[13]。本研究顯示，模型組動物血清中LP含量升高，ADPN含量降低，經香青蘭總黃酮干預后出現反轉，LP含量降低，ADPN含量升高。

HMGB1屬于一種染色質非組蛋白核蛋白，在所有真核細胞胞質內均有分布，參與細胞生長、增殖和分化等過程，在多種疾病的新生血管生成和組織細胞凋亡中起到重要作用，而HMGB1也是新近發現與2型糖尿病發生密切相關的血清學指標[14]。HMGB1可調控晚期糖基化終產物受體和Toll樣受體2種信號轉導途徑使NF-κB表達上調，并進一步促進TNF-α合成、分泌，誘發和放大炎癥反應，加重糖尿病病情[15]。本次研究發現模型動物血清中HMGB1含量明顯升高，經過香青蘭總黃酮各劑量組干預后血清含量明顯降低，可推知，香青蘭總黃酮的抗炎作用可能對HMGB1蛋白具有一定干預作用，從而降低糖尿病炎癥反應的發生。

綜上所述，香青蘭總黃酮可有效降低T2DM模型動物血清中空腹動態血糖值，降低血清中IAA、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、CRP、HMGB1、LP水平，升高血清中INS、ADPN含量，修復受損胰腺，有效控制糖尿病病情。相關作用機制可能與調控機體HMGB1蛋白有關，阻斷炎癥信號傳導，降低炎癥反應發生。但確切作用機制需進一步深入探討，明確香青蘭總黃酮具體作用位點。