IGF-1預處理對大鼠心肺復蘇術后腦水腫及炎癥反應的影響*

陸輝志，李 偉，董 輝，曹 松，楊璐瑜，廖友霞，付守芝

(武漢大學附屬同仁醫院/武漢市第三醫院急診與重癥醫學科，湖北 武漢 430060)

在全球范圍內，心臟停搏(cardiac arrest，CA)仍是導致死亡的主要原因[1]。近年來，隨著心肺復蘇技術(cardiopulmonary-cerebral resuscitation，CPR)的進步，CA患者恢復自主循環的比率有所提升，但幸存者通常發生嚴重的神經功能障礙[2-3]。復蘇后患者出現神經功能障礙的病理生理機制極其復雜，其中，心搏停止后腦缺氧導致的水腫及炎癥反應具有重要的致病作用。

胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是一個多效能激素，具有神經營養因子的作用，在神經細胞的生長、增殖、遷移及神經發生中發揮重要作用[4]。本研究將探討IGF-1對心肺復蘇大鼠腦水腫及炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

IGF-1：上海肯強貿易有限公司；TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10 ELISA檢測試劑盒：武漢博士德生物技術有限公司；MPO檢測試劑盒：武漢博士德生物技術有限公司；p-p65抗體及GAPDH抗體購自美國CST公司；多功能自動酶標儀購自美國MolecularDevices公司；高速臺式離心機購自美國Beckman公司；Westernblot儀器購自美國Bio-Rad公司；水浴恒溫搖床(SHY-2，江蘇)，紫外分光光度計(CE 2041，英國)，呼吸機(HX-200)及BL-420E+生物機能試驗系統(泰蒙公司，成都)。

1.2 實驗動物及分組

36只清潔級雄性成年SD大鼠，體重250～300g，購自上海斯萊克實驗動物中心[許可證號：SCXK(滬)2017-0005]，隨機分為3組：假手術組(Sham組)、心臟停搏/心肺復蘇組(CA/CPR組)和IGF-1處理組(IGF-1組)，每組各12只。相關動物實驗內容已通過武漢市三醫院動物實驗倫理委員會審查。動物飼養在溫度、濕度相對恒定的SPF級動物房內[溫度(24±2)℃、濕度(55±5)%]，12h晝夜交替，自由進食水，術前禁食水8h。

1.3 模型制備及實驗干預

2%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，標準肢體導聯監測心電圖。氣管切開插管；分離右頸動脈，接多導心電監護儀監測平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)；分離右側股靜脈，24號留置針穿刺置管，肝素封管備用，穩定10min后開始試驗。IGF-1組經股靜脈置管給予IGF-1，以40ng/g的劑量給藥[5]，Sham組及CA組給予等同劑量的生理鹽水。給藥30min后于呼氣末夾閉氣管導管，通過窒息誘導心臟驟停。心臟驟停標準為:心電圖示心電靜止、室顫、心電機械分離；心尖區心臟搏動消失或MAP低于20mmHg[6]。心搏停止6min后開始心肺復蘇，以食指按壓胸部，200次/min；同時恢復機械通氣，呼吸頻率為50次/min，潮氣量6mL/kg，吸氧濃度100%；經股靜脈注射腎上腺素(0.01mg/kg)；如有必要，給予電除顫(5J)。如第一次除顫后不能恢復自主心跳，則在30s后重復一次。CPR成功標準:心電圖出現正常的QRS波群，可觸及到明顯的心臟搏動或MAP升至60mmHg以上。如心肺復蘇5min未成功，則停止復蘇，宣告死亡。復蘇成功后繼續給予生命支持治療。24h后取腦組織，-80℃冰箱保存。

1.4 檢測指標

1.4.1 濕-干重比值法測定腦組織含水量

取適量腦組織，吸水紙吸干多余的水分，稱重，記為濕重；將腦組織放在100℃的烤箱中48h，烤至恒重，再次稱重，記為干重。腦含水量計算方法為：(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.2 MPO活性檢測

取適量腦組織，加入50mmol含0.5%十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide，HETAB)的PBS溶液(pH6.0)，超聲波裂解勻漿，41 000g離心10min。取上清0.3 mL，加入2.3mL反應混合物，反應混合物含50mmol PBS、聯甲氧基苯胺和20mmol H2O2溶液。在460nm處測量吸光度值，MPO活性以U/g蛋白表達[7]。

1.4.3 ELISA檢測腦組織中炎癥因子含量

嚴格按照試劑盒說明書，采用ELISA試劑盒檢測腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10(武漢博士德生物技術有限公司，武漢，中國)水平。取適量腦組織，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑，超聲波破碎儀勻漿，4℃ 12 000g離心10min，取上清。測定OD值，根據標準曲線將OD值轉換為濃度值。

1.4.4 Western blot分析

取腦組織100mg，使用蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法測蛋白濃度，以30μg蛋白上樣量計算上樣體積。加上樣緩沖液，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2h，加入p-p65及GAPDH一抗(均為兔抗，1∶1 000，CST公司)，4℃孵育過夜。TBST洗膜后加入對應的二抗，室溫孵育1h，ECL試劑發光顯色，拍照，ImageJ軟件分析測定條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值反映目的蛋白表達水平。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠腦組織含水量的比較

與Sham組相比，CA/CPR組及IGF-1組腦組織含水量顯著升高(P<0.05)；與CA組相比，IGF-1組腦組織含水量顯著降低(P<0.05)。見圖1。

與Sham組相比，*P<0.05；與CA/CPR組相比，#P<0.05，(n=12)

2.2 各組大鼠腦組織MPO活性的比較

CA/CPR組及IGF-1組MPO活性顯著高于Sham組(P<0.05)，與CA/CPR組相比，IGF-1組MPO的活性顯著降低(P<0.05)。見圖2。

與Sham組相比，*P<0.05；與CA/CPR組相比，#P<0.05，(n=12)

2.3 各組大鼠腦組織炎癥因子含量的比較

與Sham組相比，CA/CPR組及IGF-1組中炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6的含量均顯著升高；而與CA/CPR組相比，IGF-1組中3種炎癥因子含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。而腦組織中IL-10的表達量與此相反，Sham組大鼠腦組織中IL-10的含量相對較高，與Sham組相比，CA/CPR組及IGF-1組IL-10的含量均顯著降低(P<0.05)，但與CA/CPR組相比，IGF-1組中IL-10含量顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦組織炎癥因子比較

2.4 各組大鼠腦組織p-p65表達量的比較

與Sham組相比，CA/CPR組及IGF-1組p-p65的表達量增加(P<0.01)，而IGF-1組的表達水平較CA/CPR組顯著降低(P<0.05)。見圖3。

A.Westernblot典型條帶圖；B.p-p65相對表達量(與Sham組相比，*P<0.05；與CA/CPR組相比，#P<0.05)

3 討 論

CA/CPR術后腦保護一直是世界性難題，也是研究的重點和難點，減輕CPR術后腦水腫及炎癥反應對于改善幸存者預后具有重要意義。IGF-1是一種多效能激素，具有重要的生理學功能。近年來發現，IGF-1具有神經保護及神經修復作用[8]；Yang等[9]的研究表明，缺血性卒中可導致血循環中IGF-1含量減少，而經靜脈給予IGF-1后，缺血腦組織及海馬、大腦皮質中IGF-1水平明顯升高，同時觀察到大鼠的神經功能、認知功能及腦水腫得到明顯改善。本研究采用CA/CPR模型，通過測定濕/干比并進行ELISA、Western blot等相關檢測，驗證了IGF-1能減輕大鼠CPR后腦水腫及炎癥反應。

腦損傷是CA和心肺復蘇CPR幸存者致病致死的重要原因，而CA/CPR術后腦水腫是幸存者腦損傷的重要表現，CA/CPR術后腦水腫通常提示預后不良。腦水腫可分為細胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫，腦缺血主要導致細胞毒性腦水腫，而血管源性腦水腫通常出現在再灌注恢復以后[10]。CA/CPR引起全身組織器官缺血再灌注損傷，也稱心臟停搏后綜合征，既可導致細胞毒性腦水腫，又可引起血管源性腦水腫。彌漫性腦水腫可加重CA/CPR患者的腦損傷，且通常提示預后不良。本研究結果顯示，CA/CPR后大鼠腦組織含水量顯著增加；而IGF-1預處理則顯著降低了大鼠腦組織含水量，從而驗證IGF-1能改善CA/CPR后腦水腫，發揮腦保護作用。

MPO是中性粒細胞分泌的活性酶，它是中性粒細胞浸潤及活化的重要標志。心臟停搏后血液循環中斷，全身組織器官灌注不足，組織缺血必將導致氧化應激損傷進而產生大量炎癥介質。復蘇成功后，隨著血供恢復，缺血期產生的炎癥介質由損傷部位釋放入血循環，損傷血管內皮細胞，致使血管通透性增加，中性粒細胞浸潤。研究表明[11-12]，腦缺血將激活中性粒細胞，導致MPO活性升高，本研究結果與此一致，CA/CPR組大鼠腦組織MPO活性較Sham組顯著增加，而IGF-1干預則顯著降低了MPO的活性。

缺血再灌注損傷是CA/CPR的重要機制之一，腦供血中斷導致腦組織氧供及能量供應不足，激活炎癥通路，導致炎癥介質的產生和釋放，炎癥反應進一步加劇CA/CPR后腦損傷。在CA及自主循環恢復(return of spontaneous circulation，ROSC)以后，白細胞、內皮細胞和組織細胞通過一系列信號轉導通路感知損傷，釋放大量細胞因子，進一步放大局部和全身反應[13]。本研究也證實，CPR組出現強烈的炎癥反應，表現為ROSC后腦組織中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6表達顯著升高，而抗炎細胞因子IL-10則明顯下降，IGF-1干預則在一定程度上逆轉了這一結局。由此表明，IGF-1預處理能抑制CPR后腦組織炎癥反應。

NF-κB是重要的炎癥信號通路，在生理情況下處于非活化狀態，一經活化可調控多種炎癥因子的表達。心臟停搏后，全身組織器官灌注減少，引起組織缺氧，進而激活NF-κB并使其轉移到細胞核，促進炎性細胞因子的轉錄和翻譯。先前研究表明[12-13]，CA/CPR后NF-κB通路激活。本研究結果與此一致，CPR后腦組織中p-p65表達量增多，而IGF-1預處理則明顯抑制了NF-κB通路的激活。

綜上所述，本研究結果表明，IGF-1預處理能減輕CA/CPR后腦水腫及腦炎癥反應，發揮腦保護作用，其機制可能與抑制NF-κB通路有關。