Tie2突變與兒童靜脈畸形相關性研究

徐文嬋 劉珍銀 陳欽諭 張靖

靜脈畸形（venous malformation，VM）舊稱海綿狀血管瘤，是人體最常見的良性、低流速脈管畸形，屬于靜脈發育畸形，約占血管畸形總數的95%[1]。VM 發病率為 1∶5 000～1∶10 000，男∶女比例約為1∶1，可發生于身體的任何部位，頭頸部與軀干部發病率均約為40%，四肢部約為20%[2]。

目前VM的治療方式主要包括介入硬化治療、手術治療、冷凍治療、激光治療以及放射性核素敷貼等，其中手術切除現已成為輔助治療手段，如應用于硬化劑治療多次效果仍不明顯，而病灶體積巨大嚴重影響外觀與功能者等；放射性核素敷貼效果欠佳且遺留明顯的色素沉著，目前已很少應用；激光治療深部病灶如腮腺內、咬肌區的VM時，皮膚吸收較多激光而深部病灶并不能得到很好的治療，一旦增加功率又會給皮膚帶來較大損傷，因此不作為治療首選；血管內硬化介入治療是目前國際主流的治療方式，主要優勢為創傷小、療效明顯、可重復多次進行。但仍有部分患者對以上常規治療并不敏感，療效不理想，因此國內外專家進行了更深入的發病機制研究，希望能在基因層面尋找到突破口。

研究者早期即發現血管緊張素受體酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TEK，又稱Tie2），分布在血管內皮細胞、造血干細胞和促血管生成單核細胞中[3-4]，但主要是在內皮細胞中表達，其與配體ANG2發生特異性結合后對血管內皮平滑肌細胞的通訊起著關鍵性的調節作用。隨著進一步的基因靶向研究表明，Tie2/ANG2信號通路在胚胎期、成人期的血管發育中均起著重要的調節作用，各種原因引起的基因突變可導致Tie2磷酸化水平升高，致使Tie2促血管生成的活性升高，從而導致畸形血管的發生；例如家族性皮膚黏膜靜脈畸形（venous malformation,cutaneuos and mucosal，VMCM）和約50%的散發性VM是由受體Tie2突變引起的[5-9]。基于此，本研究的目的是針對Tie2突變位點與VM發生的相關性進行初步探討。

資料與方法

一、研究對象

該項研究獲得廣州市婦女兒童醫療中心醫學倫理委員會的批準和參與者的知情同意。本試驗VM病例組共納入VM患者56名，為2018年就診于廣州市婦女兒童醫療中心的患者，均符合國際診斷標準，年齡從1～10歲，平均年齡（4.5 ± 2.3）歲，男∶女比例為1∶1，病灶部位及數目詳見表1；健康對照組血液標本來自于30名健康人群，男∶女為1∶1，年齡從1～10歲，平均年齡（4.3 ± 1.2）歲。VM病例組納入標準：（1）VM患兒疾病診斷依據符合“血管瘤和脈管畸形診斷和治療指南（2016版）”；（2）獲得知情同意；（3）資料完整。排除標準：（1）資料不完整，失訪；（2）既往接受其他治療。

二、DNA提取、準備與純化

（一）主要試劑

（1） 基 因 組DNA提 取 試 劑；（2）PCR擴增試劑：引物（上海生工）；（3）瓊脂糖凝膠電泳試劑：DNA分子（Marker萊楓生物有限公司），TE緩沖液（上海生工）；（4）引物合成：PCR引物和測序引物合成由上海生工完成，針對Tie 2 基因13號外顯子的PCR正向引物F 5'-TCTGTCTGTGCCACTCTT-3'，反 向 引 物R 5'-CACGGTAATCCTATGTAA-3'，測 序 引 物5'-CACGGTAATCCTATGTAA-3'；（5） 測 序 試 劑：SAP酶（ABI公司），BDT（ABI公司），無水乙醇（上海生工）。

（二）主要步驟

1.提取外周血白細胞DNA

取外周血2 mL，用DNA提取試劑盒提取外周血白細胞DNA，所有離心操作均在室溫下進行。用洗脫緩沖液TE溶解，以紫外分光光度儀測定所有DNA樣品的純度和濃度，并保存于-80℃ 。

2.針對Tie2基因的13號外顯子進行引物設計

本試驗所設計的Tie2基因的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物見表1，PCR擴增條件流程見圖1。

表1 PCR反應體系

圖1 PCR擴增條件流程

（三）純化

利用瓊脂糖凝膠電泳方法將PCR擴增的產物按照不同分子量分開，將含有目的產物的條帶用刀片切下來，用溶劑把凝膠溶解后再濃縮，然后回收溶液中的目的DNA片斷。

三、測序及結果處理與分析

采用直接測序法，即一代測序，由上海生工完成。測序結果用Chromas軟件分析核酸序列，在NCBI網站與已知序列進行比對。把所有個體的情況錄入預先設計Excel統計表中。將各組標本的Tie2突變情況（如表2），采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。

表2 56例病例樣本—VMs的臨床特征以及Tie2基因13號外顯子突變結果

結 果

本次研究中的所有數據均使用SPSS 13.0進行統計分析。其中VM病例組與健康對照組間在年齡（t檢驗，P＞ 0.05）與性別（男∶女均為1∶1）方面均無統計學意義，數據具有可比性。本次試驗中納入的30例正常人血液標本中檢測Tie2基因的13號外顯子突變率僅為3.3%（1/30），VM病例組突變率為57.1%（32/56）。

VM病例組內進行卡方檢驗（校正公式，部分實際頻數＜ 5），χ2和P值如表3所列，P值均＞0.05，無統計學意義；即不能認為VM的Tie2基因13號外顯子突變率與性別有關，不能認為患者出生時即有病灶還是出生后才有病灶有差別，不能認為病灶位于身體不同部位的突變率有差別VM病例組與健康對照組（總數n＜ 40）組間突變率的比較使用Fisher確切概率法（見表4）進行分析，發現兩組之間突變率不同，VM病例組突變率高于健康對照組（P＜ 0.05），具有統計學意義。

表3 VMs組內突變率的比較

表4 VM病例組與健康對照組間突變率的比較

討 論

VM患者最主要的癥狀就是疼痛，由于病灶具有侵蝕性，能跨組織生長，如同時累及皮膚軟組織與深部肌肉群甚至侵犯骨膜，因此無論是硬化治療還是手術切除，都只是限制病灶的繼續生長，而無法將病灶畸形血管完全清除。為此，針對這些介入硬化、手術治療、激光治療等現有的治療方式不敏感的難治性VM，科學家們在分子機制與靶向治療上進行了一系列更深入的研究。

VM是由血管發育畸形導致的疾病，以血管發育原理為重點的研究揭示了生長因子家族和細胞信號傳導機制（包括Ang/Tie2、Notch家族、TGFB/ALK1、FGF、S1P/EDG1、信號素 /神經叢素、Netrin/UNC5B、細胞基質/整合素信號傳導，以及其他調節血管生成性甲酚酶的途徑）對血管和淋巴管的形態發生、發育、成熟及穩態都至關重要。研究證實Tie/ANGPT是內皮細胞信號主要傳導途徑之一，Tie/ANGPT家族包括Tie1、Tie2 2種受體和 Angpt1、Angpt2 和 Angpt4 3 種 配 體[10-11]，Tie2分別與Angpt1和Angpt2結合從而介導血管成熟和血管生成[12-15]。如果在小鼠基因中敲除Tie2或Angpt-1會導致血管分支畸形改變，管壁平滑肌細胞嚴重覆蓋不足[15-16]。在發育的胚胎中，Angpt-1的缺失會導致血管網紊亂，畸形擴張的血管數量也會增加[17]。

Ang/Tie2信號通路在協調內皮細胞行為、形成和重塑血管網絡的多個方面起著至關重要的作用。Tie2基因的突變可以引起血管畸形的發生，此類突變所致的VM共同點就是Tie2均有磷酸化（即活化），只是水平不等，但是目前的研究中包括本次研究均沒有發現突變率與任何臨床特征（性別、發病年齡、病灶數量、嚴重程度、類別或復發率）之間存在明顯的關聯。Ye等[18]鑒定出Tie2 17號外顯子的7個錯義突變，之前也有學者在散發性VM中報道過，但是57.1%（20/35）單突變率與L914F有關，與Limaye報道的100%（24/24）相差較遠，認為可能與人群種族不同、樣本大小不同等因素有關。Boscolo等[19]通過向免疫缺陷的小鼠注射最常見的引起VM突變類型L914F的HUVECs（人臍靜脈血管內皮細胞），從而建立小鼠VM模型，檢測雷帕霉素與Tie2抑制劑（Tie2-TKI）對小鼠VM的影響，發現雷帕霉素能夠有效降低突變體誘導的Tie2-Akt信號傳導，雖然確切機制不明但阻止VM進展的療效明顯；Tie2-TKI雖然是靶向抑制Akt信號傳導，但是作用弱，而且對Tie2具有劑量依賴性。在此基礎上Boscolo等又進行了一項前瞻性臨床試驗，對6名標準治療方式無效的VM患者采取雷帕霉素口服治療，發現雷帕霉素可明顯減輕疼痛、出血、病變大小、功能和美學損傷以及血管內凝血障礙，第一次實現了VM的分子水平的試探性治療[19]。但是后期帶來的眾多二級臨床并發癥不得不納入考慮范圍，而且口服雷帕霉素對于病灶局限的VM患者療效與劑量也未知，雖然給我們提供了新的研究方向，但是目前并不建議臨床推廣使用。

本研究中靜脈畸形患者Tie2 13號外顯子突變率較正常人群顯著升高，這為對標準療法不敏感的難治性VM提供了新的思路。雖然關于此類脈管性畸形疾病的具體發病機制尚不明確，但是相信隨著分子生物學研究的進一步深入，在不久的將來分子治療領域一定能獲得突破性進展，不僅有利于疾病治療，更有利于此類疾病的產前診斷與預防。