不同類型哮喘患者外周血ILC2s變化及其臨床意義

楊慧，曹麗麗，趙繼萍，劉曉菲，潘云，徐嘉蔚，董亮

1 山東大學齊魯醫學院，濟南250012；2 山東省千佛山醫院呼吸與危重癥醫學科；3 臨沂市人民醫院呼吸與危重癥醫學科；4 山東大學齊魯醫院呼吸與危重癥醫學科

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病[1]。一項最新的調查顯示，我國20歲及以上人群哮喘的患病率為4.2%[2]，哮喘已經成為嚴重影響我國居民健康的公共衛生問題之一。氣道慢性炎癥被認為是哮喘的基本病理改變和反復發作的主要病理生理機制，表現為IL-4、IL-5、IL-13等Th2型細胞因子釋放增多以及嗜酸性粒細胞(EOS)浸潤、黏液分泌增多和免疫球蛋白E(IgE)產生[3]。近年研究發現，哮喘小鼠2型固有淋巴細胞(ILC2s)顯著增多，而ILC2s是Th2型細胞因子的重要來源，能夠與Th2型細胞因子共同參與哮喘的發病過程[4-5]。但既往ILC2s與哮喘關系的研究多停留在動物模型實驗階段，相關的臨床研究較少。本研究觀察了不同類型哮喘患者外周血ILC2s變化，并探討其臨床意義。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年11月—2019年9月山東大學齊魯醫院收治的哮喘患者46例。根據抗原特異性IgE(sIgE)水平[1，6-7]分為過敏性哮喘(AA，sIgE≥0.35 kUA/L)21例(AA組)、非過敏性哮喘(NAA，sIgE<0.35 kUA/L)25例(NAA組)，根據外周血EOS計數[2，8]分為嗜酸性粒細胞性哮喘(EA，EOS計數≥0.3×109/L)24例(EA組)、非嗜酸性粒細胞性哮喘(NEA，EOS計數<0.3×109/L)22例(NEA組)。所有哮喘患者符合2018年全球哮喘倡議[7]和我國《支氣管哮喘診治指南》[1]中的診斷標準。納入標準：①符合哮喘診斷標準；②入組前至少4周未接受過抗哮喘藥物治療，如支氣管擴張劑、糖皮質激素、白三烯受體拮抗劑、茶堿類藥物等。排除標準：①年齡<18歲或>65歲者；②合并其他肺部疾病者，如支氣管擴張癥、間質性肺疾病、肺良惡性腫瘤等；③合并心、肝、腦、腎等重要臟器嚴重疾病者；④合并免疫系統疾病者；⑤妊娠期或哺乳期婦女。AA組男12例、女9例，年齡19～65(43.19±15.09)歲，BMI(23.64±3.49)kg/m2；NAA組男10例、女15例，年齡25～65(47.44±10.42)歲，BMI(25.66±2.86)kg/m2。EA組男10例、女14例，年齡22～65(45.33±12.68)歲，BMI(24.71±3.19)kg/m2；NEA組男12例、女10例，年齡19～65(45.68±13.21)歲，BMI(24.76±3.47)kg/m2。同期隨機選取在山東大學齊魯醫院體檢健康的志愿者13例(NC組)，均無變應性疾病史或過敏史，近3個月內無感染史或用藥史。其中，男4例、女9例，年齡23～65(42.69±13.57)歲，BMI 26.30(23.15，28.20)kg/m2。AA組、NAA組、NC組基本臨床資料具有可比性，EA組、NEA組、NC組基本臨床資料亦具有可比性。本研究經山東大學齊魯醫院醫學倫理委員會批準[批準號：KYLL-2017(KS)-112]，所有研究對象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 外周血ILC2s檢測 采集所有研究對象清晨空腹外周靜脈血2 mL，置于含EDTA的真空采血管中。取100 μL于1.5 mL EP管中，加入紅細胞裂解液300 μL，充分混勻，冰上靜置15 min。4 ℃下450×g離心10 min(離心半徑99 mm)，棄上清液，向沉淀中加入紅細胞裂解液200 μL，充分混勻。以相同條件再次離心，棄上清液。向沉淀中加入PBS 1 mL重懸，4 ℃下1 300 r/min離心5 min(離心半徑99 mm)，棄上清液。向沉淀中加入人Fc受體結合抑制劑20 μL，充分混勻，室溫靜置15 min。4 ℃下1 300 r/min離心5 min(離心半徑99 mm)，棄上清液。向沉淀中加入PBS 1 mL重懸，4 ℃下1 300 r/min離心5 min(離心半徑99 mm)，棄上清液。向沉淀中分別加入FITC-Lin抗體20 μL、PE/Cy5-CD127抗體5 μL、PE-CRTH2抗體5 μL和PBS 70 μL，充分混勻，室溫避光孵育15 min。取上述混合液100 μL加入PBS 1 mL重懸，4 ℃下1 300 r/min離心5 min(離心半徑99 mm)，棄上清液。向所得沉淀中加入PBS 1 mL重懸，重懸液經300目一次性過濾網過濾，將濾出液轉移至新的離心管中。2 h內上流式細胞儀檢測，分選Lin-CD127+CRTH2+的淋巴細胞并定義為ILC2s[6]，所得數據用FlowJo軟件進行分析。

1.3 血清sIgE檢測 采集哮喘患者清晨空腹外周靜脈血2 mL，4 ℃下3 000 r/min離心10 min(離心半徑99 mm)，留取上層血清，采用ELISA法檢測血清sIgE。

1.4 血漿總免疫球蛋白E(tIgE)、IL-5、IL-13檢測 采集哮喘患者清晨空腹外周靜脈血2 mL，置于含EDTA的真空采血管中，4 ℃下5 500 r/min離心15 min(離心半徑99 mm)，留取上層血漿。采用ELISA法檢測血漿tIgE、IL-5、IL-13。

1.5 EOS檢測 采集哮喘患者清晨空腹外周靜脈血2 mL，經全自動血細胞分析儀檢測EOS數量。

1.6 肺功能檢測 哮喘患者入組當日采用肺功能測試儀檢測第1秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1%pred)、第1秒用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)。

2 結果

2.1 AA患者和NAA患者外周血ILC2s變化及其與IL-5、IL-13、sIgE、tIgE水平以及EOS計數、FEV1%pred、FEV1/FVC的關系

2.1.1 三組外周血ILC2s、IL-5、IL-13、sIgE、tIgE水平和EOS計數以及FEV1%pred、FEV1/FVC比較 見表1、2。

表1 三組外周血ILC2s、IL-5、IL-13水平及EOS計數比較

表2 三組外周血sIgE、tIgE水平及FEV1%pred、FEV1/FVC比較

2.1.2 AA患者和NAA患者外周血ILC2s與IL-5、IL-13、sIgE、tIgE以及EOS計數、FEV1%pred、FEV1/FVC的關系 AA患者和NAA患者外周血ILC2s與IL-5(r分別為0.86、0.74)、IL-13(r分別為0.53、0.57)和EOS計數(r分別為0.76、0.84)均呈正相關關系(P均<0.05)，與sIgE(r分別為-0.01、0.10)、tIgE(r分別為-0.12、0.38)和FEV1/FVC(r分別為-0.24、-0.34)均無明顯相關性(P均>0.05)。AA患者外周血ILC2s與FEV1%pred無明顯相關性(r=-0.30，P>0.05)，而NAA患者外周血ILC2s與FEV1%pred呈負相關關系(r=-0.41，P<0.05)。

2.2 EA患者和NEA患者外周血ILC2s變化及其與IL-5、IL-13、sIgE、tIgE水平以及EOS計數、FEV1%pred、FEV1/FVC的關系

2.2.1 三組外周血ILC2s、IL-5、IL-13、sIgE、tIgE水平和EOS計數以及FEV1%pred、FEV1/FVC比較 見表3、4。

表3 三組外周血ILC2s、IL-5、IL-13水平及EOS計數比較[M(P25，P75)]

表4 三組外周血sIgE、tIgE水平和FEV1%pred、FEV1/FVC比較

2.2.2 EA患者和NEA患者外周血ILC2s與IL-5、IL-13、sIgE、tIgE和EOS計數以及FEV1%pred、FEV1/FVC的關系 EA患者外周血ILC2s與IL-5、IL-13、tIgE和EOS計數均呈正相關關系(r分別為0.67、0.65、0.61、0.70，P均<0.05)，與FEV1%pred呈負相關關系(r=-0.52，P<0.05)，而與sIgE、FEV1/FVC無明顯相關性(r分別為0.12、-0.37，P>0.05)。NEA患者外周血ILC2s與IL-5、IL-13、sIgE、tIgE和EOS計數以及FEV1%pred、FEV1/FVC均無明顯相關性(r分別為0.39、-0.25、0.28、0.14、0.25、0.22、0.17，P均>0.05)。

3 討論

近年來，哮喘的發病率和病死率持續上升，已成為全球第二大致死和致殘疾病[9]。目前，越來越多學者認為哮喘是一種異質性肺病綜合征[10]，根據臨床表現和發病機制不同，可分為不同的表型和內型。如根據致病因素不同分為AA、NAA以及自發性哮喘[11]，根據氣道主要浸潤的炎癥細胞不同分為EA和NEA。這種不同的表型或內型，使哮喘的臨床表現、嚴重程度以及對治療的反應性存在明顯差別。

ILC2s是由骨髓造血干細胞分化而來的，最早由MJOSBERG等[12]在健康嬰幼兒和成人腸道、肺、外周血中發現的一種CRTH2+lin-CD127+CD45+固有淋巴樣細胞，其在IL-2、IL-25、IL-33等刺激下可分泌大量IL-13。有研究報道，哮喘患者誘導痰中ILC2s明顯升高[8]。在哮喘小鼠肺泡灌洗液中發現ILC2s明顯升高，并證實ILC2s是IL-5、IL-13的重要來源細胞[3,13]。結果提示，ILC2s和Th2型細胞因子在哮喘發病過程中可能發揮重要作用。

AA是指接觸花粉、塵螨、過冷空氣等過敏原導致Th2型細胞因子(如IL-4、IL-5、IL-13)水平升高，從而引起的一種氣道慢性炎癥性疾病，早期被認為是一種適應性Th2細胞介導的免疫反應[5]。但HALIM等[14]研究發現，ILC2s與Th2型細胞因子共同介導AA的發病過程，并且即使不依賴于適應性免疫應答，ILC2s仍可誘導IL-5、IL-13產生，提示固有免疫在AA的發病過程中發揮重要作用。NAA通常被認為是由非Th2型免疫反應介導，具有成人遲發性發病的特點。但國外一項研究發現，NAA患者外周血ILC2s顯著高于健康志愿者[15]。提示ILC2s可能參與NAA的發病過程。本研究AA患者外周血ILC2s明顯高于健康志愿者，并且外周血ILC2s與IL-5、IL-13呈正相關關系，與既往研究[14]結果一致。提示ILC2s可能通過介導Th2型細胞因子IL-5、IL-13產生，參與AA的發病過程。本研究還發現，AA患者外周血IL-13水平較NAA患者和健康志愿者顯著升高，而外周血IL-5水平雖然高于健康志愿者，但與NAA患者比較差異無統計學意義。說明IL-13可能在AA的發病過程中具有更為重要的作用。TANG等[16]在非變應性哮喘患者肺泡灌洗液、外周血單核細胞中均發現IL-5水平升高。本研究結果亦發現，NAA患者外周血ILC2s、IL-5水平均高于健康志愿者。提示IL-5可能參與NAA的發病過程。sIgE和tIgE是由B細胞分化成的漿細胞分泌產生的免疫球蛋白。本研究AA患者外周血sIgE、tIgE水平均高于NAA患者，但AA患者和NAA患者外周血sIgE、tIgE水平均與外周血ILC2s無明顯相關性，提示ILC2s可能與變應反應無明顯關系。本研究結果還發現，AA患者與NAA患者FEV1%pred、FEV1/FVC比較差異均無統計學意義，并且FEV1/FVC與外周血ILC2s無明顯相關性，AA患者外周血ILC2s與FEV1%pred無明顯相關性，而NAA患者外周血ILC2s與FEV1%pred呈負相關關系。我國《支氣管哮喘診治指南》將哮喘分為間歇狀態、輕度持續、中度持續、重度持續4級，而FEV1%pred是評價哮喘嚴重程度分級的重要指標[1]。由此可見，ILC2s或能反映哮喘嚴重程度。

SMITH等[17]研究發現，EA在大劑量糖皮質激素作用下，ILC2s仍可通過局部不受控制地產生Th2型細胞因子IL-5、IL-13，從而促進哮喘患者EOS持續增多。但臨床鮮見ILC2s與NEA關系的報道。本研究EA患者外周血ILC2s、IL-5水平顯著高于NEA患者，但血漿IL-13水平與NEA患者比較差異無統計學意義。提示IL-5在EA的發病過程中可能具有重要作用。而NEA患者外周血ILC2s和Th2型細胞因子水平與健康志愿者比較差異均無統計學意義，說明NEA可能是一種非Th2型、非ILC2s介導的免疫反應。本研究EA患者外周血EOS計數顯著高于NEA患者，進一步證實EA存在高嗜酸性粒細胞血癥狀態。EA患者與NEA患者外周血sIgE、tIgE水平比較差異均無統計學意義，但EA患者外周血ILC2s與外周血tIgE水平呈正相關關系。提示ILC2s或能參與調控tIgE產生。此外，EA患者與NEA患者FEV1%pred比較差異無統計學意義，EA患者FEV1/FVC明顯低于NEA患者；相關性分析發現，EA患者外周血ILC2s與FEV1%pred呈負相關關系，與FEV1/FVC無明顯相關性，NEA患者外周血ILC2s與FEV1%pred、FEV1/FVC均無明顯相關性。但這并不能說明EA患者與NEA患者存在肺功能差異，需要進一步驗證。

綜上所述，外周血ILC2s可能通過介導Th2型細胞因子產生，參與AA、NAA和EA的發病過程，并可作為評估哮喘嚴重程度的指標，但其對NEA發病的影響不大。