絕經后骨質疏松癥患者血清miR-21和Smad7表達變化及其臨床意義

何至，顏端國，嚴林

1 監利市人民醫院骨一科，湖北監利433300；2 華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院骨一科

絕經后骨質疏松癥(PMOP)是發生于絕經后婦女的一種常見代謝性疾病，由于雌激素缺乏導致骨量減少和骨組織結構變化，骨脆性增加而易于發生骨折，是中老年婦女生活質量降低以及致殘或致死的重要原因[1]。研究證實，表觀遺傳學參與PMOP的發生、發展。微小RNA(miRNA)是一類長度為20～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA。有研究報道，部分miRNA能夠通過調控破骨細胞和成骨細胞分化，參與PMOP的發生、發展[2]。miR-21是miRNA家族成員之一，定位于人染色體17q23.2。PERKSANUSAK等[3]研究發現，PMOP患者血清miR-21表達明顯降低，提示miR-21能夠參與PMOP的發生、發展。Smad同源物7(Smad7)是在成骨分化和骨形成過程中起重要作用的TGF-β信號通路的內源性負反饋調節因子。Smad7能夠抑制成骨細胞增殖和分化，從而影響骨形成和骨分化[4]。LI等[5]研究發現，miR-21能夠通過調節Smad7促進成骨細胞增殖、分化和礦化。鄧純博等[6]研究報道，在通過雙側卵巢切除去勢建立的骨質疏松癥(OP)小鼠模型骨組織中miR-21表達明顯降低，而Smad7表達明顯升高，提示miR-21、Smad7可能參與PMOP的發生、發展。但目前PMOP患者血清miR-21、Smad7表達變化及其與骨密度和骨代謝關系的研究相對較少。本研究探討了PMOP患者血清miR-21、Smad7表達變化及其臨床意義。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月—2020年1月監利市人民醫院收治的PMOP患者40例(骨質疏松組)。納入標準：①符合《原發性骨質疏松癥診治指南》中關于PMOP的診斷標準[7]；②初診，入院前未接受任何抗骨質疏松治療；③年齡50～75歲；④絕經1年以上。排除標準：①合并自身免疫功能異常者；②存在肝腎功能不全者；③合并甲狀腺或甲狀旁腺疾病、糖尿病、垂體疾病等影響骨代謝疾病者；④合并心腦血管疾病者；⑤臨床資料不完整者。同期另選在監利市人民醫院就診的，與骨質疏松組臨床資料相匹配的絕經后骨密度降低(-2.5 SD≤骨密度<-1.0 SD)患者40例(骨密度降低組)和絕經后骨密度正常(-1.0 SD≤骨密度≤1.0 SD)健康志愿者40例(骨密度正常組)。其中，骨質疏松組年齡(61.4±4.8)歲，BMI(21.56±4.68)kg/m2，有吸煙史21例，合并高血壓6例、高脂血癥4例；骨密度降低組年齡(60.3±5.2)歲，BMI(21.78±4.57)kg/m2，有吸煙史19例，合并高血壓5例、高脂血癥3例；骨密度正常組年齡(59.7±4.5)歲，BMI(23.17±4.43)kg/m2，有吸煙史22例，合并高血壓4例、高脂血癥5例。三組年齡、BMI、吸煙史、合并癥等具有可比性。本研究經監利市人民醫院醫學倫理委員會批準(審批編號：20170106)，所有研究對象或其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 血清miR-21、Smad7 mRNA表達檢測 采集所有研究對象就診當日清晨空腹肘靜脈血5 mL，置于含EDTA的真空采血管中，4 ℃下3 000 r/min離心10 min(離心半徑13.5 cm)，留取上層血清，-80 ℃冰箱保存。采用TRIzol法提取血清總RNA，經紫外可見分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明，將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA為模板，按SYBR?Premix EX TaqTMⅡ說明進行PCR擴增。引物序列：miR-21上游引物5′-GCGGTAGCTTATCAGACTGA-3′、下游引物5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′，內參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；Smad7上游引物5′-TGTCCAGATGCTGTGCCTTCCT-3′、下游引物5′-CTCGTCTTCTCCTCCCAGTATG-3′，內參GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′、下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。PCR反應體系共25 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，dH2O 8.5 μL；反應條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共40個循環。PCR反應結束后繪制熔解曲線，收集循環閾值(CT)數。以U6或GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 血清β-膠原降解產物(β-CTX)、1型前膠原氨基端延長肽(P1NP)檢測 采集所有研究對象就診當日清晨空腹肘靜脈血5 mL，置于含EDTA的真空采血管中，4 ℃下3 000 r/min離心10 min(離心半徑13.5 cm)，留取上層血清，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測血清β-CTX、P1NP。試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司，所有操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.4 骨密度檢測 所有研究對象就診當日由專業技術人員使用雙能X射線骨密度儀檢測股骨、腰椎骨密度。

2 結果

2.1 三組血清miR-21、Smad7 mRNA表達比較 見表1。

表1 三組血清miR-21、Smad7 mRNA相對表達量比較

2.2 三組血清β-CTX、P1NP水平和股骨、腰椎骨密度比較 見表2。

表2 三組血清β-CTX、P1NP水平和股骨、腰椎骨密度比較

2.3 PMOP患者血清miR-21、Smad7 mRNA表達與血清β-CTX、P1NP水平及股骨、腰椎骨密度的關系 Pearson相關分析顯示，PMOP患者血清miR-21表達與血清β-CTX、P1NP水平均呈負相關關系(r分別為-0.667、-0.562，P均<0.05)，與股骨、腰椎骨密度均呈正相關關系(r分別為0.549、0.538，P均<0.05)；血清Smad7 mRNA表達與血清β-CTX、P1NP水平均呈正相關關系(r分別為0.710、0.535，P均<0.05)，與股骨、腰椎骨密度均呈負相關關系(r分別為-0.604、-0.555，P均<0.05)；PMOP患者血清miR-21表達與Smad7 mRNA表達呈負相關關系(r=-0.525，P<0.05)。

2.4 血清miR-21、Smad7 mRNA表達對PMOP的診斷效能分析 ROC曲線分析顯示，血清miR-21表達診斷PMOP的曲線下面積(AUC)為0.945(95%CI：0.910～0.981)，其cut off值為0.585，此時其診斷PMOP的靈敏度為80.0%、特異度為95.0%；血清Smad7 mRNA表達診斷PMOP的AUC為0.927(95%CI：0.877～0.977)，其cut off值為1.905，此時其診斷PMOP的靈敏度為78.8%、特異度為92.3%；二者聯合診斷PMOP的AUC為0.978(95%CI：0.950～1.000)，其診斷PMOP的靈敏度為99.8%、特異度為92.7%。

3 討論

OP是一種以骨量降低、骨微結構破壞、骨質脆性增加和易于骨折為特征的全身代謝性骨病。絕經后婦女是OP的高發人群，其患病率超過50%，骨折率達到10%[8]。絕經后婦女卵巢功能衰退，體內雌激素水平下降，導致破骨細胞和成骨細胞的代謝失衡，骨吸收亢進，表現為骨密度下降，骨脆性增加，極易發生骨折[9-10]。隨著人口老齡化加劇，PMOP越來越受到重視。骨代謝包括骨形成和骨吸收兩個生化過程。隨著對骨代謝研究的不斷深入，骨形成標志物和骨吸收標志物已成為診治代謝性骨病的特異性指標。β-CTX是細胞外基質中的膠原纖維降解產物，能夠反映骨基質降解速率，而P1NP則能夠反映Ⅰ型膠原合成速度和成骨細胞活性，二者均與骨代謝、骨密度密切相關。雖然近年來骨代謝標志物在診斷PMOP方面取得了一定進展，但因其易受其他因素干擾，特異度較低，在PMOP早期診斷中的價值不能令人滿意[11]。

miRNA是一種廣泛存在的調控基因表達的小分子RNA。有研究報道，部分miRNA能夠通過調控破骨細胞和成骨細胞分化參與PMOP的發生、發展[2]。miR-21定位于人染色體17q23.2，在調節細胞生長、發育及代謝等方面具有重要作用[12-13]。有研究發現，miR-21與成骨細胞分化和礦化有關[5]。Smad7是TGF-β信號通路的內源性負反饋調節因子，能夠參與調控細胞增殖、分化、凋亡等一系列生物學活動[14-16]。有研究報道，PMOP患者血清miR-21表達明顯降低；在雙側卵巢切除去勢建立的骨質疏松癥小鼠模型骨組織中miR-21表達明顯降低，而Smad7表達明顯升高[3，6]。提示miR-21和Smad7可能是參與PMOP發生、發展的重要因子。β-CTX、P1NP是反映骨代謝的特異性標志物，二者水平升高往往意味著骨轉換速率加快，即骨量丟失增加、骨密度降低[17]。

本研究結果發現，骨質疏松組血清miR-21表達明顯低于骨密度降低組和骨密度正常組,血清Smad7 mRNA表達和血清β-CTX、P1NP水平均明顯高于骨密度降低組和骨密度正常組；并且骨密度降低組血清miR-21表達明顯低于骨密度正常組，血清Smad7 mRNA表達和血清β-CTX、P1NP水平均明顯高于骨密度正常組。提示miR-21、Smad7可能參與PMOP的發生、發展過程。有研究報道，miR-21能夠介導Smad7下調來促進成骨細胞分化[18]。本研究Pearson相關分析顯示，PMOP患者血清miR-21表達與股骨、腰椎骨密度均呈正相關關系，與血清β-CTX、P1NP水平均呈負相關關系；血清Smad7 mRNA表達與股骨、腰椎骨密度均呈負相關關系，與血清β-CTX、P1NP水平均呈正相關關系；PMOP患者血清miR-21表達與Smad7 mRNA表達呈負相關關系。提示miR-21與Smad7可能共同參與PMOP的發生、發展。

本研究ROC曲線分析顯示，血清miR-21、Smad7 mRNA表達對PMOP均具有一定診斷價值，二者聯合時診斷價值更高。提示血清miR-21、Smad7可作為早期診斷PMOP的生物學標志物。

綜上所述，PMOP患者血清miR-21表達降低、Smad7表達升高，二者可能共同參與PMOP的發生、發展；血清miR-21、Smad7表達對PMOP均具有較高的診斷價值，二者聯合時診斷價值更高。