DNMT抑制劑5-AzaDc對結直腸癌肝轉移的影響

孫紹偉，張煥虎，曹金，宮慶，韓傳吉

山東大學附屬威海市立醫院胃腸外科，山東威海264200

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，在我國其發病率和病死率分別居惡性腫瘤的第3位和第5位[1-2]。手術切除仍然是目前結直腸癌最主要的治療手段，但術后轉移的風險較高。據報道，50%～60%結直腸癌患者術后發生肝轉移[3]。因此，早期發現并控制結直腸癌肝轉移就顯得尤為重要。近年研究證實，DNA甲基化與腫瘤惡性生物學行為密切相關[4]。與基因突變不同，DNA甲基化是由DNA甲基轉移酶(DNMT)催化完成的一種表觀遺傳學修飾，在促癌基因或抑癌基因的表達調控中具有至關重要的作用[5]。因此，DNMT被認為是惡性腫瘤的一個潛在治療靶標。VERLAAT等[6]研究發現，DNMT抑制劑在維持腫瘤細胞中DNA甲基化沉默的腫瘤抑制基因重新表達方面具有明顯效果。5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-AzaDc)，中文名為地西他濱，是一種新型DNMT抑制劑。5-AzaDc能夠在DNA復制過程中替代胞嘧啶，競爭性結合DNMT，抑制DNMT活性，從而達到抑制DNA甲基化的作用。目前，5-AzaDc主要作為惡性血液病的治療藥物，用于治療結直腸癌的報道較少，對結直腸癌肝轉移的治療更是鮮有報道。2020年1月—3月，本研究構建了裸鼠結直腸癌肝轉移模型，觀察了DNMT抑制劑5-AzaDc對結直腸癌肝轉移的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性BALB/c裸鼠50只，SPF級，6～8周齡，體質量180～240 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2019-0015。所有裸鼠于屏障系統動物房內獨立通風籠具中單籠飼養，自由攝食和飲水。飼養環境：溫度(25±3)℃，相對濕度55%～60%，光照12 h明暗交替。實驗設計和實施過程符合動物福利和倫理要求。人結直腸癌細胞系HCT116(以下稱HCT116細胞)，購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。DNMT抑制劑5-AzaDc，純度≥97%，購自美國Sigma-Aldrich公司。酶標儀，購自上海昂拉儀器有限公司；Accuri C6 Plus流式細胞儀，購自北京賽百奧科技有限公司。DNMT活性檢測試劑盒，購自美國Epigentek公司。

1.2 動物分組處理 所有裸鼠適應性喂養1周，按隨機數字表法隨機分為模型組、對照組以及5-AzaDc低、中、高劑量組，每組10只。模型組和5-AzaDc低、中、高劑量組通過脾臟種植法構建結直腸癌肝轉移模型。具體方法：將HCT116細胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養，以獲取足夠數量的HCT116細胞；裸鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，常規消毒，選擇左背部斜切口進腹暴露脾臟，將HCT116細胞緩慢注入脾臟，待脾臟被膜腫脹、變白后，壓迫止血并殺滅可能外滲的HCT116細胞，然后將脾臟放回原位，關腹。對照組予戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，選擇左背部斜切口進腹暴露脾臟，但不注入HCT116細胞，隨即關腹。麻醉清醒后，常規飼養，當裸鼠出現明顯消瘦、行動遲緩、弓背、精神萎靡等現象時，5-AzaDc低、中、高劑量組分別腹腔注射1.0 μmol/L 5-AzaDc 0.3、0.4、0.5 mg/kg，每周1次，連續注射8周。對照組和模型組腹腔注射等量生理鹽水，每周1次，連續注射8周。

1.3 觀察指標 各組腹腔注射8周后，采集外周靜脈血2 mL保存備用，然后頸椎脫臼處死，無菌條件下剖腹取肝轉移瘤組織，PBS沖洗干凈，保存備用。

1.3.1 DNMT活性 取部分肝轉移瘤組織，剪碎、消化、再培養后，經流式細胞儀分離，獲取肝轉移瘤細胞。按DNMT活性檢測試劑盒說明檢測DNMT活性。

1.3.2 腫瘤球數量 取部分肝轉移瘤組織，剪碎、消化、再培養后，經流式細胞儀分離，獲取肝轉移瘤細胞。將肝轉移瘤細胞以500個/孔密度接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱內常規培養。從培養第3天開始，隔天于顯微鏡下觀察腫瘤球形成情況。培養2周時，顯微鏡下拍照，計數直徑>40 μm的腫瘤球數量。

1.3.3 細胞存活率 取部分肝轉移瘤組織，剪碎、消化、再培養后，經流式細胞儀分離，獲取肝轉移瘤細胞。取肝轉移瘤細胞1×106個，PBS洗滌后，用結合緩沖液稀釋成密度為4×105個/mL細胞懸液，室溫下避光孵育10 min，上流式細胞儀檢測。

1.3.4 血清CD44v6、VEGF檢測 取大鼠外周靜脈血，3 000 r/min離心10 mim、離心半徑8 cm，留取上層血清。采用ELISA法檢測血清CD44v6、VEGF。試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，所有操作嚴格按試劑盒說明進行。

2 結果

2.1 各組肝轉移瘤細胞DNMT活性比較 對照組僅開腹，脾臟未注入HCT116細胞，無肝轉移瘤細胞形成。模型組與5-AzaDc低、中、高劑量組肝轉移瘤細胞DNMT活性分別為13.24±1.01、9.22±2.22、5.12±1.03、4.34±1.24。隨著5-AzaDc濃度升高，各組肝轉移瘤細胞DNMT活性逐漸降低(F=39.495，P<0.05)。5-AzaDc低、中、高劑量組肝轉移瘤細胞DNMT活性均低于模型組(P均<0.05)，5-AzaDc中、高劑量組肝轉移瘤細胞DNMT活性低于5-AzaDc低劑量組(P均<0.05)，而5-AzaDc中劑量組與5-AzaDc低劑量組肝轉移瘤細胞DNMT活性比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組肝轉移瘤細胞腫瘤球數量和細胞存活率比較 對照組僅開腹，脾臟未注入HCT116細胞，無肝轉移瘤細胞形成。模型組與5-AzaDc低、中、高劑量組肝轉移瘤細胞腫瘤球數量和細胞存活率比較見表1。

表1 模型組與5-AzaDc低、中、高劑量組肝轉移瘤細胞腫瘤球數量和細胞存活率比較

2.3 各組血清CD44v6、VEGF水平比較 見表2。

表2 各組血清CD44v6、VEGF水平比較

3 討論

肝臟是結直腸癌血行轉移最主要的靶器官，臨床上10%～25%結直腸癌患者一經確診便已發生肝轉移，另有20%～25%結直腸癌患者在接受根治性手術后3年內出現肝轉移[7-8]。肝轉移是影響結直腸癌患者預后的重要因素，亦是導致患者死亡的主要原因，據報道約30%結直腸癌患者死于肝轉移[9-10]。目前，臨床治療結直腸癌主要采取手術聯合放化療，但遠期效果不佳，肝轉移是導致治療失敗的重要原因[11-12]。因此，探索一種治療結直腸癌肝轉移的有效手段，對改善患者預后具有重要意義。

近年來，隨著表觀遺傳學研究不斷深入，啟動子區高甲基化引起的多種抑癌基因失活被認為可能是惡性腫瘤發生的重要原因。DNA甲基化是由DNMT催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將活性甲基轉移至DNA鏈中特定堿基上的化學修飾過程。作為一種表觀遺傳學修飾，DNA甲基化可在不改變DNA序列的前提下，對個體生長、發育以及基因表達等發揮重要的調控作用，并且這種修飾在細胞增殖過程中可穩定傳遞。因此，DNA甲基化對腫瘤細胞的干性調控以及維持過程具有至關重要的作用[13-15]。5-AzaDc是一種新型DNMT抑制劑，可在DNA復制過程中替代胞嘧啶，競爭性結合DNMT，抑制DNMT活性，從而干擾DNMT對基因表達的調控作用。以往5-AzaDc主要用于治療惡性血液病，用于治療結直腸癌的報道較少，對結直腸癌肝轉移的治療更是鮮有報道。

本研究結果發現，模型組與5-AzaDc低、中、高劑量組肝轉移瘤細胞DNMT活性逐漸降低；5-AzaDc低、中、高劑量組肝轉移瘤細胞DNMT活性均低于模型組,并且5-AzaDc中、高劑量組肝轉移瘤細胞DNMT活性低于5-AzaDc低劑量組，而5-AzaDc中劑量組與5-AzaDc高劑量組肝轉移瘤細胞DNMT活性比較差異無統計學意義。提示5-AzaDc能夠抑制結直腸癌肝轉移瘤細胞DNMT活性，并且隨著5-AzaDc劑量增加，其作用效果越來越明顯。本研究結果還發現，模型組與5-AzaDc低、中、高劑量組腫瘤球數量和細胞存活率均逐漸降低；5-AzaDc低、中、高劑量組腫瘤球數量和細胞存活率均低于模型組，并且5-AzaDc中、高劑量組腫瘤球數量和細胞存活率均低于5-AzaDc低劑量組，而5-AzaDc中劑量組腫瘤球數量和細胞存活率與5-AzaDc高劑量組比較差異無統計學意義。結果提示，5-AzaDc能夠抑制肝轉移廇細胞成瘤能力和侵襲能力。DNMT能夠通過調控Wnt/β-catenin信號通路抑制SFTP1基因甲基化，在結直腸癌干細胞干性維持中具有至關重要的作用。而5-AzaDc通過抑制DNMT活性調控Wnt/β-catenin信號通路，促使SFTP1基因去甲基化，進而抑制結直腸癌干細胞干性以及肝轉移瘤細胞增殖和侵襲。此外，5-AzaDc作為新型DNMT抑制劑，能夠通過共價鍵與DNMT結合并形成不可逆的復合物，從而導致DNMT活性受到抑制，促使基因組甲基化水平降低，重新激活因高甲基化而失活的重要抑癌基因，最終發揮抗腫瘤作用。

CD44是一種分布極為廣泛的細胞表面跨膜糖蛋白，CD44v6是其家族的重要成員。CD44v6過表達多見于轉移力強的腫瘤細胞。CD44v6能夠通過介導淋巴細胞歸巢以及改變腫瘤細胞骨架構象和分布，影響腫瘤細胞的運動能力，使腫瘤細胞獲得轉移潛能，從而形成轉移瘤并穩固寄宿和生長。CD44v6因與腫瘤侵襲和轉移關系密切而受到廣泛關注。在結直腸癌患者中，CD44v6高表達通常與肝轉移和不良預后密切相關。VEGF是新生血管形成的關鍵性調控因子，在惡性腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用。血清VEGF水平升高可促進新生血管形成，增加腫瘤轉移概率；血清VEGF水平升高還能增加血管通透性，使血漿蛋白外滲，從而為血管內皮細胞遷移和腫瘤轉移提供基質[16]。本研究結果發現，模型組和5-AzaDc低、中、高劑量組血清CD44v6、VEGF水平均高于對照組；5-AzaDc低、中、高劑量組血清CD44v6、VEGF水平均低于模型組，并且5-AzaDc中、高劑量組血清CD44v6、VEGF水平均低于5-AzaDc低劑量組，而5-AzaDc中劑量組血清CD44v6、VEGF水平與5-AzaDc高劑量組比較差異均無統計學意義。提示5-AzaDc能夠抑制結直腸癌肝轉移裸鼠血清CD44v6、VEGF水平，進而阻止腫瘤侵襲和轉移。5-AzaDc可能通過抑制DNMT活性進而影響CD44v6、VEGF基因啟動子區域中CpG島甲基化，從而使血清CD44v6、VEGF水平降低。

綜上所述，5-AzaDc對結直腸癌肝轉移具有一定抑制作用，其作用機制可能與抑制腫瘤血管形成有關。但目前5-AzaDc抑制結直腸癌肝轉移的具體作用機制仍不完全清楚，尚需進一步研究。