miR-191靶向調控SATB1對肝癌細胞增殖和侵襲的影響

陳紅英，高貴峰，閆少茹，王春艷，王長友

1 唐山市中醫醫院普外科，河北唐山060300；2 唐山市人民醫院骨科；3 華北理工大學附屬醫院普外科

肝癌是全球常見的消化系統惡性腫瘤之一。我國是肝癌的高發國家之一，盡管近年來人口標準化發病率和病死率得到顯著改善，但肝癌的疾病負擔仍然較重[1]。目前，肝癌的治療方式包括手術、放化療、靶向治療等，但中晚期肝癌即使經積極治療，5年生存率仍不足20%[2-3]。迄今為止，肝癌發病的確切分子機制仍不完全清楚。因此，深入探索肝癌發病的分子機制，對尋找肝癌精準治療的新靶點具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類長度為19～25個核苷酸的內源性非編碼小RNA分子。miRNA不僅能參與細胞增殖、分化、凋亡以及胚胎發育等正常生物學過程，其表達失衡還能參與惡性腫瘤的發生、發展[4]。miR-191是一個由22個堿基組成的非編碼RNA，定位于人染色體3p21.31。有研究報道，miR-191可通過抑制表皮生長因子受體(EGFR)信號通路抑制細胞增殖；而在乳腺癌[5]、惡性腦膜瘤[6]等組織中miR-191表達下調，引起EGFR信號通路過度激活，從而促進了腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等惡性生物學行為。特異AT序列結合蛋白1(SATB1)是一種組織特異性的核基質附著區結合蛋白，它能以獨特的模式識別并結合于基質附著區，從而參與染色質重塑、組蛋白乙酰化和甲基化等修飾過程[7]。有研究發現，在食管鱗癌[8]、結直腸癌[9]等組織中SATB1過表達，并且其過表達能夠激活血小板源性生長因子受體，從而促進腫瘤細胞的增殖和侵襲。近年研究發現，抑制miR-191表達可導致SATB1表達上調，從而激活Wnt信號通路，繼而引起腫瘤惡性進展[10]。但目前在肝癌中miR-191與SATB1的調控關系尚不清楚。2020年4月—2021年6月，本研究探討了miR-191靶向調控SATB1對肝癌細胞增殖和侵襲的影響?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞系HepG2、正常肝細胞系L02(以下分別稱HepG2、L02細胞)，購自美國模式菌種收集中心。引物序列、SATB1過表達質粒及其陰性對照質粒、miR-191 mimic，均由北京華大集團設計合成。7500型實時熒光定量PCR儀，購自美國ABI公司；SpectraMax L化學發光型酶標儀，購自美國Molecular Devices公司；NanoDrop 1000超微量分光光度計，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、SATB1、Cyclin D1、p27、GAPDH單克隆抗體以及相應的二抗，購自英國Abcam公司。MTT細胞增殖檢測試劑盒，購自美國Promega公司；Transwell小室，購自美國Corning公司；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，購自美國ABI公司；Lipofectamine2000瞬時轉染試劑，購自美國Invitrogen公司；Nano-Glo?Dual-Luciferase Reporter (NanoDLRTM) Assay，購自美國Promega公司。

1.2 細胞傳代培養 將HepG2、L02細胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養基，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養。待細胞融合至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶4傳代。取傳4代、對數生長期、生長狀態良好的細胞用于后續實驗。

1.3 miR-191、SATB1表達檢測 ①miR-191、SATB1 mRNA表達：采用RT-PCR技術。取HepG2、L02細胞各1×105個，按RNeasy Plus提取試劑盒說明提取細胞總RNA，經NanoDrop 1000超微量分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續實驗。然后按逆轉錄試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明進行PCR擴增。引物序列：miR-191上游引物5′-CAACGGAATCCCAAAAGCAGCTG-3′、下游引物5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCT-3′，內參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物3′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-5′；SATB1上游引物5′-GATCATTTGAACGAGGCAACTCA-3′、下游引物5′-TGGACCCTTCGGATCACTCA-3′，內參GAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR擴增體系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL；反應條件：94 ℃ 15 s，94 ℃ 10 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 10 s共35個循環(miR-191)；95 ℃ 10 s，95 ℃ 40 s、62 ℃ 60 s、72 ℃ 10 s共40個循環(SATB1 mRNA)。PCR擴增反應結束，繪制熔解曲線，收集循環閾值(CT)數。分別以U6或GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算miR-191、SATB1 mRNA相對表達量。②SATB1蛋白表達：采用Western blotting法。取HepG2、L02細胞各1×105個，加入含PMSF的RIPA裂解液提取細胞核蛋白，經BCA法蛋白定量合格后，加入上樣緩沖液，105 ℃金屬浴15 min，SDS-PAGE分離。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉2 h，然后分別加入SATB1、GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。ECL顯色，暗室內顯影、定影。Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值，以GAPDH為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.4 miR-191和SATB1結合位點預測與驗證 借助在線生物信息學軟件starBase(http：//starbase.sysu.edu.cn/)和TargetScan7.2(http：//www.targetscan.org/vert_72/)預測miR-191與SATB1的結合位點。

根據突變位點分別設計SATB1野生型(WT)和突變型(MT)質粒。將HepG2細胞接種于24孔板，每孔6×104個，隨機分為SATB1 WT組、SATB1 MT組、SATB1 WT+miR-191 mimic組、SATB1 MT+miR-191 mimic組。當細胞融合80%～90%時，按Lipofectamine2000瞬時轉染試劑說明，SATB1 WT組轉染SATB1 WT質粒、SATB1 MT組轉染SATB1 MT質粒、SATB1 WT+miR-191 mimic組轉染SATB1 WT質粒+miR-191 mimic、SATB1 MT+miR-191 mimic組轉染SATB1 MT質粒+miR-191 mimic。轉染6 h后更換培養基，繼續培養48 h，收集細胞，按Nano-Glo?Dual-Luciferase Reporter (NanoDLRTM) Assay說明檢測各組熒光素酶活性。

1.5 細胞轉染 將HepG2細胞接種于12孔板，每孔2×105個，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養24 h，隨機分為對照組、SATB1組、miR-191 mimic組、SATB1+miR-191 mimic組。按Lipofectamine2000瞬時轉染試劑說明，對照組轉染陰性對照質粒，SATB1組轉染SATB1過表達質粒，miR-191 mimic組轉染miR-191 mimic，SATB1+miR-191 mimic組轉染SATB1過表達質粒和miR-191 mimic。轉染6 h后更換培養基，繼續培養48 h，收集細胞用于后續實驗。

1.6 細胞增殖能力檢測 將各組轉染后HepG2細胞接種于96孔板，每孔1×104個，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養。待細胞貼壁后，分別于0、24、48、72 h加入MTT試劑20 μL，繼續培養4 h，再加入DMSO 150 μL，振蕩混勻，使結晶充分溶解。酶標儀于560 nm波長處檢測各孔的光密度(OD)值。以OD560值代表細胞增殖活性。

1.7 細胞侵襲能力檢測 將Matrigel用RPMI 1640培養基按1∶8包被Transwell小室底部膜的上室面，37 ℃下靜置30 min。將各組轉染后HepG2細胞重懸，制成密度為1×105/mL的細胞懸液。取細胞懸液200 μL加入Transwell小室上室，下室加入含10% FBS的RPMI 1640培養基500 μL。然后將Transwell小室置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養24 h，取出Transwell小室，用棉簽輕輕拭去上室面未穿膜細胞，10%多聚甲醛固定30 min，0.5%結晶紫染色10 min。顯微鏡下隨機選取5個400倍不重疊視野，計數穿膜細胞數。以穿膜細胞數代表細胞侵襲能力。

1.8 Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1、p27蛋白表達檢測 將各組轉染后HepG2細胞接種于6孔板，每孔2×105個，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養。待細胞融合80%～90%時，加入含PMSF的RIPA裂解液提取細胞核蛋白，經BCA法蛋白定量合格后，加入上樣緩沖液，105 ℃金屬浴15 min，SDS-PAGE分離。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉2 h，然后分別加入Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1、p27、GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。ECL顯色，暗室內顯影、定影。Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 HepG2細胞與L02細胞miR-191、SATB1表達比較 HepG2細胞與L02細胞miR-191相對表達量分別為0.504±0.117、1.312±0.214，SATB1 mRNA相對表達量分別為1.662±0.326、0.732±0.183，SATB1蛋白相對表達量分別為0.811±0.220、0.203±0.044。HepG2細胞miR-191相對表達量低于L02細胞(t=6.440，P<0.01)，而SATB1 mRNA和蛋白相對表達量均高于L02細胞(t分別為8.125、8.130，P均<0.01)。

2.2 miR-191與SATB1的靶向調控關系 經在線生物信息學軟件starBase和TargetScan7.2預測，miR-191與SATB1存在相互作用位點，見圖1。SATB1 WT組、SATB1 WT+miR-191 mimic組、SATB1 MT+miR-191 mimic組及SATB1 MT組熒光素酶活性分別為3.117±0.415、1.209±0.227、3.440±0.328、3.246±0.334。SATB1 WT+miR-191 mimic組熒光素酶活性明顯低于SATB1 WT組、SATB1 MT+miR-191 mimic組、SATB1 MT組(t分別為6.136、7.204、6.415，P均<0.01)。

圖1 miR-191與SATB1的結合位點示意圖

2.3 各組細胞增殖和侵襲能力比較 見表1。

表1 各組細胞增殖和侵襲能力比較

2.4 各組Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1、p27蛋白表達比較 見表2。

表2 各組Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1、p27蛋白相對表達量比較

3 討論

肝癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一。盡管近年來我國肝癌的發病率和病死率呈下降趨勢，但我國人口基數大，肝癌的疾病負擔仍然十分嚴重[11]。目前，肝癌的治療方式包括手術、放化療、靶向治療等，但肝癌早期癥狀不典型，一旦出現典型癥狀就診時，病情已進展至中晚期，治療效果不佳，預后較差。迄今為止，肝癌發病的確切分子機制仍不完全清楚。因此，深入探索肝癌發病的分子機制，對尋找肝癌精準治療的新靶點具有重要意義。

miRNA是一類長度為19～25個核苷酸的內源性非編碼小RNA分子，由RNA聚合酶Ⅱ轉錄合成后被Dicer剪切形成成熟miRNA，參與形成RNA誘導的沉默復合物，識別并結合下游靶基因mRNA的3′非編碼區，降低靶基因mRNA的穩定性或轉錄后抑制靶基因的表達。miR-191屬于miRNA家族成員之一，定位于人染色體3p21.31。有研究報道，肝癌組織miR-191表達下調，其表達下調可導致Kruppel樣因子6(KLF6)等下游靶基因表達異常增加，繼而引起腫瘤細胞惡性增殖[12]。SHARMA等[5]研究發現，在乳腺癌細胞中miR-191表達下調，其表達下調可導致下游轉錄因子SOX4過表達，從而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移。本研究結果發現，HepG2細胞miR-191表達顯著低于L02細胞。提示miR-191在肝癌中可能發揮抑癌基因作用，其表達下調的原因可能與miR-191易受表觀遺傳學修飾調控有關。邱必軍等[13]研究表明，肝癌中一些miRNA，如miR-125b、miR-191，存在過度甲基化現象，甲基化修飾可導致肝癌細胞中miR-191表達沉默。ZHOU等[10]研究發現，在肺腺癌細胞中miR-191通過與SATB1 mRNA的3′非編碼區結合抑制SATB1表達，從而抑制Wnt信號通路傳導，進而促進肺腺癌細胞的增殖、侵襲、遷移等惡性生物學行為。

SATB1是一種組織特異性核基質附著區結合蛋白，它能以獨特的模式識別并結合于基質附著區，從而參與染色質重塑、組蛋白乙?；图谆刃揎椷^程[7]。SATB1過表達能夠促進腫瘤細胞的增殖、侵襲并抑制其凋亡，從而促進腫瘤的發生、發展[8-9]。龔丹等[14]研究表明，在肝癌組織中SATB1存在異常高表達現象，其異常高表達能夠激活EGFR、血管內皮生長因子等信號通路，從而促進肝癌細胞無限增殖。本研究結果發現，與L02細胞比較，HepG2細胞SATB1 mRNA和蛋白表達均顯著升高，究其原因可能與SATB1表達受miRNA(如miR-191)轉錄后表達調控有關。經在線生物信息學軟件starBase和TargetScan7.2預測，miR-191與SATB1存在結合位點，雙熒光素酶報告基因實驗證實，在HepG2細胞中miR-191能夠靶向抑制SATB1表達。因此，肝癌細胞SATB1表達受miR-191的靶向調控。

本研究進一步觀察了miR-191/SATB1對肝癌細胞增殖和侵襲的影響，結果發現SATB1過表達能夠促進HepG2細胞的增殖和侵襲能力。有研究報道，SATB1過表達能夠促進下游癌基因(如EGFR)表達，抑制抑癌基因(如細胞間黏附分子)表達[14]。有研究報道，SATB1過表達可抑制肝癌細胞Hep3B、Bel-7402凋亡，而敲低SATB1表達則可抑制Hep3B、Bel-7402細胞的生長和增殖[15]。本研究還發現，SATB1過表達后，HepG2細胞增殖相關基因如Cyclin D1和上皮間質轉化相關標志物N-cadherin、Vimentin表達升高，表明SATB1過表達能夠通過激活Cyclin D1表達促進HepG2細胞周期轉換，導致HepG2細胞惡性增殖。有研究發現，SATB1能夠通過促進G1/S期轉換，促進細胞周期進行，導致腫瘤細胞增殖加快[16]。SATB1能夠通過上調上皮間質轉化通路中的間質性標志物表達，促進HepG2細胞上皮間質轉化，增強腫瘤細胞的侵襲能力。此外，HUO等[17]研究發現，SATB1能夠促進p21活化激酶5(PAK5)磷酸化，PAK5激活后促進腫瘤細胞上皮間質轉化，導致腫瘤細胞局部浸潤和遷移。本研究利用瞬時轉染技術轉染miR-191 mimic促進miR-191表達，結果發現HepG2細胞增殖和侵襲能力顯著降低，而轉染miR-191 mimic能夠逆轉SATB1過表達，增強HepG2細胞的增殖和侵襲能力，進一步證實miR-191是通過靶向SATB1抑制HepG2細胞的增殖和侵襲。提示miR-191/SATB1可通過促進腫瘤細胞周期轉換和上皮間質轉化而發揮作用，二者有可能成為肝癌潛在的治療靶點。

綜上所述，miR-191通過靶向負調控SATB1抑制肝癌細胞的增殖和侵襲，其機制可能與miR-191/SATB1軸能夠改變增殖相關蛋白Cyclin D1、p27表達以及上皮間質轉化相關蛋白Vimentin、E-cadherin、N-cadherin表達有關。