健康成年人舌苔表象與舌苔微生態的關系

肖池，何彩紅，王安鴿，譚中菊，趙新秀，廖俏云，李金優，歸崎峰

1 杭州醫學院基礎醫學與法醫學院，杭州310003；2 浙江大學醫學院附屬第一醫院老年醫學科

舌苔是指覆蓋在舌背面上的一層苔狀物，主要由脫落的角化上皮、唾液、食物碎屑、細菌等組成。舌苔是中醫舌診的重要內容，也是中醫臨床辨證不可缺少的客觀依據，能夠反映機體內部的正邪斗爭、氣血盛衰、寒熱虛實[1]。現階段，舌苔形成的機制是中醫現代化基礎研究的一個重要方向。舌苔微生態作為一個相對完整且獨立的微生態系統，因其在舌苔形成過程中具有重要作用而受到眾多學者關注[2-5]。研究證實，多種疾病可導致舌苔微生態發生顯著變化，而舌苔菌群變化能夠為中醫病證診斷提供依據[1，6]。但目前在健康人群中舌苔與舌苔微生態關系的研究較少。本研究以健康成年人為研究對象，運用高通量測序技術，觀察了不同舌苔類型舌苔微生態的結構特點，旨在從微生態學角度闡釋健康成年人不同舌苔類型的形成機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年6月—2020年10月在浙江大學醫學院附屬第一醫院、紹興市越城區斗門鎮衛生院和浙江古纖道綠色纖維有限公司體檢健康的成年志愿者79例。納入標準：①身體狀態良好，無任何不適癥狀或體征；②年齡18～59歲；③取樣前1周保持正常飲食習慣；④人口學資料完整。排除標準：①合并高血壓、糖尿病、高脂血癥等基礎疾病者；②合并HBV、HCV、HIV等病毒感染者；③有胃腸道手術史者；④合并精神疾病者；⑤取樣前8周內行口腔正畸手術者，或使用益生菌、益生元、合生元及抗生素者；⑥取樣前4周內做過腸道準備者。參照《中醫診斷學》、《中醫舌診圖譜》中舌苔分類標準，由浙江大學醫學院附屬第一醫院一位經驗豐富的中醫師診查舌苔。根據舌苔質地將研究對象分為膩苔組43例、薄苔組36例。其中，膩苔組男25例、女18例，平均年齡42歲，BMI(23.5±2.7)kg/m2，城鎮人口27例、農村人口16例，有吸煙史12例，有飲酒史6例，黃膩苔22例、白膩苔21例；薄苔組男14例、女22例，平均年齡36歲，BMI(22.7±3.4)kg/m2，城鎮人口28例、農村人口8例，有吸煙史7例，有飲酒史2例，薄白苔28例、薄黃苔8例。兩組性別、年齡、BMI、人口來源比較差異均無統計學意義，而有吸煙史和飲酒史比例比較差異均有統計學意義。本研究由浙江大學醫學院附屬第一醫院設計與實施，符合《赫爾辛基宣言(2013年版)》，并經醫院臨床研究倫理委員會批準[批件號：(2019)科研快審第(1026)號]，所有研究對象知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 舌苔樣本收集與處理 留樣當日，所有研究對象于清晨空腹、不刷牙狀態下，用兩根無菌棉簽在舌苔表面輕輕擦拭3次，將棉簽頭端折斷后置于2 mL凍存管中，1 h內轉存于-80 ℃冰箱保存。舌苔樣本成批后送至北京諾禾致源科技股份有限公司檢測和分析。

1.3 基因組DNA提取、PCR擴增純化和文庫構建 采用CTAB法提取樣本基因組DNA，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，提取的基因組DNA純度和濃度合格。取適量基因組DNA置于離心管中，用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶barcode的特異引物，擴增區域為16sv34。引物序列：①341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′；②806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′。按Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶說明進行PCR擴增。反應條件：98 ℃ 1 min，98 ℃ 10 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共30個循環，最后72 ℃ 5 min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的條帶采用GeneJET凝膠回收試劑盒回收。采用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit構建文庫，經過Qubit和qPCR定量合格后，NovaSeq 6000測序系統測序。

1.4 生物信息學分析 測序數據經Reads拼接得到原始Tags數據，嚴格過濾處理獲得高質量Clean Tags數據，然后與物種注釋數據庫進行比對，最終得到有效的Tags數據。利用Uparse算法對有效的Tags數據進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單位(OTUs)，然后對OTUs序列進行物種注釋，獲得分類學信息并分別在各個分類水平上統計各樣本的菌群組成，通過R軟件(Version 2.15.3)構建Veen圖。采用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Chao1、ACE、Shannon、Simpson、Goods coverage和Observed species指數，然后用R軟件分析α多樣性指數的組間差異。采用Qiime軟件計算Weighted UniFrac距離，通過R軟件繪制主成分分析(PCA)圖和主坐標分析(PCoA)圖并評估組間的β多樣性。采用線性判別分析效應值(LEfSe)軟件分析LEfSe，設置線性判別分析(LDA)的篩選值為4。

2 結果

2.1 兩組舌苔微生物α、β多樣性分析 經高通量測序分析，79例健康成年志愿者舌苔標本中共檢出2 099個OTUs。其中，膩苔組和薄苔組共享的OTUs共1 233個，膩苔組和薄苔組獨有的OTUs分別為458、408個，兩組OTUs比較差異無統計學意義(P>0.05)。

α多樣性分析發現，膩苔組與薄苔組Chao1指數分別為345.13±82.15、349.02±88.44，ACE指數分別為348.96±82.46、352.35±91.45，Shannon指數分別為4.93±0.36、4.87±0.44，Simpson指數分別為0.93±0.02、0.92±0.04，Goods coverage指數分別為1.00±0.00、1.00±0.00，Observed species指數分別為287.33±60.02、286.58±69.80，兩組上述指數比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖1。

注：TF為薄苔組，GF為膩苔組；a為Chao1指數，b為ACE指數，c為Shannon指數，d為Simpson指數，e為Goods coverage指數，f為Observed species指數。

β多樣性分析發現，膩苔組與薄苔組菌群均傾向于聚集，提示兩組菌群結構相似度較高。見插頁Ⅰ圖1。

2.2 兩組差異物種分析 LEfSe分布柱狀圖展示了LDA>4的差異物種，其中膩苔組放線菌綱、乳桿菌目、微球菌目和鏈球菌科是差異物種，而薄苔組紫單胞菌科是差異物種。見插頁Ⅰ圖2。

進化分支圖同樣顯示了兩組間的差異物種，并且在由門至屬的分類級別上揭示了差異物種的所屬關系。見插頁Ⅰ圖3。

3 討論

舌苔作為口腔微生物的主要定植部位，其口腔微生物的數量和種類遠高于口腔其他部位。因此，舌苔微生態成為口腔微生態研究的主要對象。此外，舌苔微生態還與中醫辨證施治密切相關[1]。根據張伯禮院士對6 708例健康人群舌苔類型的研究發現，健康人群舌苔類型以黃膩苔、白膩苔、薄白苔、薄黃苔最為常見，占95%以上[7]。本研究健康成年志愿者舌苔類型均為上述四種類型，與張伯禮等[7]研究結果吻合。本研究根據舌苔質地將研究對象分為膩苔組和薄苔組，然后提取舌苔樣本基因組DNA，經PCR擴增純化和文庫構建后進行生物信息學分析，結果發現兩組共享的OTUs共1 233個，膩苔組和薄苔組獨有的OTUs分別為458、408個，兩組OTUs比較差異無統計學意義；α多樣性分析發現，兩組Chao1、ACE、Shannon、Simpson、Goods coverage、Observed species指數比較差異均無統計學意義；β多樣性分析亦顯示，兩組菌群均傾向于聚集，提示兩組菌群結構相似度較高。結果表明健康人群的舌苔微生態相對穩定，究其原因可能與舌具有一定的自潔作用有關[8]。但本研究通過LEfSe分析發現，兩組存在差異物種，其中膩苔組放線菌綱、乳桿菌目、微球菌目和鏈球菌科是差異物種，而薄苔組紫單胞菌科是差異物種，與既往文獻[9]報道基本一致。結果表明，不同舌苔類型的菌群結構存在差異，而這些差異菌群可能在相應的舌苔類型形成過程中起重要作用。

放線菌屬是人類口腔內的優勢菌群之一[10]。與非吸煙者比較，吸煙者口腔放線菌門富集，相對豐度較高[11]。本研究結果發現，膩苔組放線菌綱富集明顯高于薄苔組，與國內馬廣強等[9]研究結果一致，其原因可能與膩苔組有吸煙史比例高于薄苔組有關。國內李華等[5]研究發現，放線菌屬豐度和舌苔的苔量、苔厚、苔膩呈明顯正相關關系。由此推測，放線菌有可能是形成膩苔的主要微生物因素之一，并且從舌苔微生態角度上也能更好地解釋吸煙可使舌苔變厚這一現象[12]。放線菌可能和人類某些疾病有一定聯系。有研究報道，糖尿病患者口腔放線菌檢出率明顯升高，放線菌有可能增加受檢者罹患糖尿病的風險[13]。此外，放線菌還可通過口腔或牙齦傷口侵入組織內部，在人體免疫力下降時易誘發慢性膿腫[14]。因此，健康人群出現膩苔可在一定程度上預示體內潛在疾病的發生風險增加。

本研究結果發現，膩苔組乳桿菌目和鏈球菌科豐度明顯高于薄苔組。乳桿菌雖然是一種有益菌，但它也有對機體不利的一面。乳桿菌能夠與口腔中的鏈球菌一起使糖類發酵產生乳酸或其他酸類物質，溶解牙釉質，導致齲齒、牙周炎等口腔疾病[15]。王菁等[16]對口臭患者與健康志愿者舌背微生態的菌群結構研究發現，口臭患者舌苔微生態發生了顯著改變，其特有的細菌高達17種，其中鏈球菌檢出率最高。有研究報道，口臭、牙周炎等口腔疾病與舌苔厚度呈明顯正相關關系[17-18]。提示乳桿菌和鏈球菌可能通過口腔疾病導致膩苔形成。

本研究結果發現，薄苔組紫單胞菌科豐度明顯高于膩苔組，與既往文獻[9]報道基本一致。紫單胞菌科屬于擬桿菌目，包括卟啉單胞菌屬、巴氏菌屬等，是人和動物口腔、胃腸道的正常菌群，在維持口腔微生態平衡中具有重要作用。其中，卟啉單胞菌是一種小型厭氧革蘭陰性非運動球菌，作為正常菌群的一部分存在于人類口腔內，對維持口腔健康具有重要作用[9]。正常人的舌苔由于口腔微生態穩定，舌上皮細胞正常生長、分化且不存在明顯炎癥，這為薄白苔舌象形成奠定了基礎[19]。

綜上所述，健康成年人不同舌苔表象具有不同的舌苔微生態特征，其中放線菌綱、乳桿菌目、微球菌目和鏈球菌科是膩苔的差異物種，紫單胞菌科是薄苔的差異物種，這些菌群差異可能是不同舌苔類型形成的微生態基礎。但本研究還存在一定局限性，如僅比較了薄苔和膩苔的微生態差異，對更加細化的舌苔類型未進一步探討，中醫辨證和舌苔微生態的關系亦未闡明；只評估了舌苔的微生態特征，而對兩者相互作用的機制未進一步闡明；未進行吸煙、飲酒、運動、飲食等因素對舌苔及其微生態的共發生網絡進行分析。