基于生物信息學(xué)方法篩選結(jié)腸癌進(jìn)展相關(guān)的樞紐基因

王成呂，聶玉潔，潘潤桑，朱蘭，陳雙會，陳輝,，張湘燕,，聶瑛潔,

1 貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系，貴陽550025;2 貴州省人民醫(yī)院肺臟免疫性疾病診治實驗室;3貴陽市兒童醫(yī)院骨科

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，也是世界范圍內(nèi)男性第三大常見惡性腫瘤、女性第二大常見惡性腫瘤[1-2]。迄今為止，結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，可能是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[3]。腫瘤治療的選擇主要依據(jù)臨床分期，不同臨床分期腫瘤的治療手段不同，預(yù)后差異較大。但目前臨床卻面臨缺乏早期診斷和預(yù)后判斷生物標(biāo)志物的難題。通過挖掘與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的生物標(biāo)志物，針對性地進(jìn)行干預(yù)治療，從而提高治療效果，改善患者預(yù)后。近年來，隨著高通量測序技術(shù)和DNA芯片技術(shù)發(fā)展，實現(xiàn)了快速檢測成千上萬個基因轉(zhuǎn)錄體的表達(dá)，為探索結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[4]。2020年10月—2021年4月，我們基于GEO數(shù)據(jù)庫中的結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集，篩選了與結(jié)腸癌進(jìn)展相關(guān)的差異表達(dá)基因(DEGs)，旨在尋找結(jié)腸癌新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 登錄美國國立生物技術(shù)信息中心GEO數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，以“colon cancer”為檢索詞，篩選獲得GSE127069、GSE145626兩個數(shù)據(jù)集。GSE127069數(shù)據(jù)集基于GPL17077平臺，采用Agilent-039494 SurePrint G3 Human GE v2 8×60K Microarray 039381陣列芯片檢測；GSE145626數(shù)據(jù)集基于GPL23126平臺，采用[Clariom_D_Human] Affymetrix Human Clariom D Assay陣列芯片檢測。GSE127069數(shù)據(jù)集包括結(jié)腸癌組織樣本和正常組織樣本各6例份，GSE145626數(shù)據(jù)集包括結(jié)腸癌組織樣本和正常組織樣本各3例份。

1.2 DEGs篩選 運用GEO數(shù)據(jù)庫在線分析工具GEO2R提取GSE127069、GSE145626數(shù)據(jù)集中的原始數(shù)據(jù)，利用韋恩圖在線分析工具(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)篩選結(jié)腸癌組織樣本和正常組織樣本中的DEGs。篩選條件為P<0.05且|log2FC|>2(FC為差異倍數(shù))。

1.3 GO功能注釋和KEGG通路富集分析 利用基因功能注釋在線工具DAVID(https：//david.ncifcrf.gov)對GSE127069、GSE145626數(shù)據(jù)集中的DEGs進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析。

1.4 蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與樞紐基因篩選 將獲得的DEGs數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，下載TSV文件并導(dǎo)入Cytoscape軟件，通過CytoHubba插件篩選樞紐基因。

1.5 樞紐基因表達(dá)驗證 將篩選獲得的樞紐基因?qū)隚EPIA數(shù)據(jù)庫(http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html)進(jìn)行驗證，選擇腫瘤類型為結(jié)腸腺癌，分析樞紐基因在結(jié)腸癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌DEGs篩選 從GSE127069數(shù)據(jù)集中共獲取表達(dá)上調(diào)基因599個、表達(dá)下調(diào)基因784個；從GSE145626數(shù)據(jù)集中共獲取表達(dá)上調(diào)基因228個、表達(dá)下調(diào)基因940個。以P<0.05且|log2FC|>2為篩選條件，經(jīng)韋恩圖在線分析工具篩選，共從GSE127069、GSE145626數(shù)據(jù)集中獲得DEGs 142個，其中表達(dá)上調(diào)基因35個、表達(dá)下調(diào)基因107個，見圖1。

注：A為GSE127069、GSE145626數(shù)據(jù)集中表達(dá)上調(diào)基因；B為GSE127069、GSE145626數(shù)據(jù)集中表達(dá)下調(diào)基因。

2.2 GO功能注釋和KEGG通路富集分析結(jié)果 見表1、2。

表1 DEGs的GO功能注釋結(jié)果

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與樞紐基因篩選結(jié)果 利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。利用CytoHubba插件篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中相互作用排名前10位的DEGs作為樞紐基因，分別為IL-6、GCG、SLC26A3、TIMP1、SPP1、TMIGD1、MYC、MMP3、MMP1、SLC9A2。

表2 DEGs的KEGG通路富集分析結(jié)果

注：淺灰色為篩選出來的樞紐基因。

2.4 樞紐基因表達(dá)驗證 結(jié)腸癌組織GCG、TMIGD1表達(dá)低于癌旁組織，TIMP1、SPP1、MYC、MMP3、MMP1表達(dá)高于癌旁組織(P均<0.05)；而結(jié)腸癌組織與癌旁組織IL-6、SLC26A3、SLC9A2表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。

注：A為IL-6，B為GCG，C為SLC26A3，D為TIMP1，E為SPP1，F(xiàn)為TMIGD1，G為MYC，H為MMP3，I為MMP1，J為SLC9A2；*表示P<0.05。

3 討論

結(jié)腸癌的發(fā)生是一個多基因參與的過程，具有很大的異質(zhì)性[5]。目前，臨床對結(jié)腸癌仍缺乏有效的治療手段，故深入探索結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制，對其早期診斷、靶向治療和預(yù)后評估具有積極意義。隨著生物醫(yī)學(xué)不斷進(jìn)步，人們對結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制有了更多的認(rèn)識。基因異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)，具有作為腫瘤標(biāo)志物的潛力[6]。DNA甲基化、非編碼RNA異常、組蛋白修飾等表觀遺傳學(xué)改變能夠參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，可作為潛在的腫瘤標(biāo)志物[7]。YANG等[8]研究認(rèn)為，DNA甲基化的分子亞型對結(jié)腸癌預(yù)后評估具有重要價值。XU等[9]研究發(fā)現(xiàn)，部分長鏈非編碼RNA可促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展并可導(dǎo)致患者預(yù)后不良。以上研究提示，尋找潛在的腫瘤標(biāo)志物將有利于結(jié)腸癌的早期篩查和預(yù)后評估。

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取GSE127069、GSE145626數(shù)據(jù)集，通過GEO2R在線分析工具提取原始數(shù)據(jù)，以P<0.05且|log2FC|>2為篩選條件，經(jīng)韋恩圖在線分析工具篩選，共從GSE127069、GSE145626數(shù)據(jù)集中獲得DEGs 142個，其中表達(dá)上調(diào)基因35個、表達(dá)下調(diào)基因107個。GO功能注釋發(fā)現(xiàn)，這些DEGs的生物學(xué)過程主要涉及細(xì)胞外基質(zhì)降解、氧化還原過程、細(xì)胞黏附，分子功能主要涉及鈣離子結(jié)合、碳酸鹽脫水酶活性，細(xì)胞組分主要涉及胞外區(qū)域、膜的組成。KEGG通路富集分析顯示，這些DEGs主要涉及PI3K-Akt通路和代謝途徑通路。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)由基底膜和細(xì)胞間質(zhì)組成。ZHONG等[10]研究報道，ECM與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。CHAUDHURI等[11]研究認(rèn)為，ECM的硬度與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力密切相關(guān)，軟化的基底膜可促進(jìn)腫瘤出芽。PI3K/Akt信號通路能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化等生物學(xué)過程[12]。實體腫瘤微環(huán)境的營養(yǎng)限制使得腫瘤細(xì)胞進(jìn)化出靈活的代謝方式以維持生長和存活。BOROUGHS等[13]研究報道，代謝通路具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的能力。

本研究利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，通過CytoHubba插件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中相互作用排名前10位的DEGs作為樞紐基因，分別為IL-6、GCG、SLC26A3、TIMP1、SPP1、TMIGD1、MYC、MMP3、MMP1、SLC9A2。進(jìn)一步利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織GCG、TMIGD1表達(dá)低于癌旁組織，TIMP1、SPP1、MYC、MMP3、MMP1表達(dá)高于癌旁組織，而結(jié)腸癌組織與癌旁組織IL-6、SLC26A3、SLC9A2表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。IL-6是由活化的T細(xì)胞及成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，IL-6在癌組織與癌旁組織中的表達(dá)比較無統(tǒng)計學(xué)差異，并且其表達(dá)與腫瘤分期和患者總生存期亦無明顯相關(guān)性，但在本研究PPI網(wǎng)絡(luò)中其相互作用排名第一，提示IL-6在結(jié)腸癌中的作用不容忽視。IL-6信號通路與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、耐藥性等密切相關(guān)。IL-6下調(diào)能夠抑制腫瘤血管生成，提高抗腫瘤藥物療效[14-15]。若IL-6表達(dá)上調(diào)則有利于腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視，促進(jìn)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。LIANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6與腫瘤進(jìn)展和患者預(yù)后密切相關(guān)，是腫瘤微環(huán)境中的一個重要因子，具有作為結(jié)腸癌標(biāo)志物的潛力。至于GEPIA數(shù)據(jù)庫中癌組織與癌旁組織中IL-6表達(dá)比較無統(tǒng)計學(xué)差異，可能與樣本量大小、樣本來源、腫瘤進(jìn)展程度等因素和本研究不同有關(guān)。GCG是胰高血糖素，該基因編碼的蛋白是一種前原蛋白，可通過AMPK與MAPK通路作用，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[17]。丁志祥等[18]利用生物信息學(xué)方法篩選結(jié)腸癌的樞紐基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP1、MMP3、MYC和SPP1為結(jié)腸癌的樞紐基因，這些樞紐基因在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，本研究結(jié)果與其相似。MMP1和MMP3均屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，MYC是一種轉(zhuǎn)錄因子，SPP1為分泌磷蛋白1，這四種基因在多種腫瘤的發(fā)生和侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。TIMP1是金屬蛋白酶抑制劑1，其在癌組織中高表達(dá)，可通過抑制金屬蛋白酶介導(dǎo)的ECM參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。ZENG等[20]研究發(fā)現(xiàn)，TIMP1表達(dá)與結(jié)腸癌進(jìn)展密切相關(guān)。TAN等[21]研究發(fā)現(xiàn)，TIMP1表達(dá)下調(diào)能夠增強(qiáng)胰腺癌對化療藥物的敏感性。TMIGD1蛋白是包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白家族成員，是一種細(xì)胞表面糖蛋白，也是一種黏附分子，在結(jié)合膜突蛋白后可調(diào)節(jié)微管蛋白的乙酰化，并能促進(jìn)細(xì)胞遷移[22]。SLC26A3和SLC9A2均為溶質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員，二者多在上皮組織的管腔膜中表達(dá)，可發(fā)揮陰離子交換器功能，可能與結(jié)腸癌的進(jìn)展有關(guān)[23]。

總之，本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)分析工具共篩選出10個與結(jié)腸癌進(jìn)展相關(guān)的樞紐基因，分別為IL-6、GCG、SLC26A3、TIMP1、SPP1、TMIGD1、MYC、MMP3、MMP1、SLC9A2等，這些樞紐基因的差異表達(dá)可能是結(jié)腸癌進(jìn)展的重要原因。