食管癌組織miR-122-5p、CREB1 mRNA表達變化及其臨床意義

鄧偉明，李道航，孟凡亮

1 安徽醫科大學附屬巢湖醫院心胸外科，安徽巢湖238000；2 安徽醫科大學附屬巢湖醫院呼吸與危重癥醫學科

食管癌是上消化道常見的惡性腫瘤，也是全球第八大常見惡性腫瘤。由于早期癥狀不典型，大多數食管癌患者就診時已進展至晚期，而對于晚期食管癌只能采取化療、放療、分子靶向治療等，但治療效果欠佳[1]。目前，食管癌的發病機制尚不完全清楚。因此，探索食管癌發生、發展的分子機制對其早期診斷和靶向治療具有重要意義。非編碼RNA是一類不編碼蛋白的RNA，但這類RNA在基因轉錄水平、轉錄后水平及翻譯水平具有重要的調控作用，能夠參與調控細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程[2]。微小RNA-122-5p(miR-122-5p)是一種小分子非編碼RNA。有研究報道，miR-122-5p可作為癌基因或抑癌基因，參與多種惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等[3-4]。環磷酸腺苷反應元件結合蛋白1(CREB1)是一種調節基因轉錄的蛋白質，可通過調控下游靶基因表達，參與細胞增殖、分化、周期調控等生物學活動，其異常表達與多種惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等密切相關[5-6]。但miR-122-5p、CREB1在食管癌發生、發展中的作用尚不清楚。本研究觀察了食管癌組織miR-122-5p、CREB1 mRNA表達變化，并分析其表達變化與患者臨床病理特征和預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月—2018年3月安徽醫科大學附屬巢湖醫院收治的食管癌患者92例。所有患者經術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合食管癌診斷標準；②初診；③接受根治性或姑息性切除手術；④術前未接受任何抗腫瘤治療；⑤臨床病理資料和術后隨訪資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并心、肝、腎等重要臟器嚴重疾病者；③合并全身感染性疾病者；④合并血液系統疾病者。其中，男56例、女36例，年齡41～87(58.24±7.18)歲；病理類型：腺癌32例，鱗癌60例；腫瘤直徑：≥4 cm 45例，<4 cm 47例；組織分化程度：低分化48例，中高分化44例；TNM分期[7]：Ⅰ、Ⅱ期66例，Ⅲ、Ⅳ期26例；有淋巴結轉移22例，無淋巴結轉移70例。本研究經安徽醫科大學附屬巢湖醫院醫學倫理委員會批準(審批編號：KYXM-202109-018)，患者或其家屬知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 miR-122-5p、CREB1 mRNA表達檢測 采用RT-qPCR技術。取手術切除的胃癌組織及其配對的癌旁組織(距腫瘤組織邊緣>5 cm，經術后組織病理檢查證實為正常胃組織)，液氮下充分研磨，采用TRIzol法提取組織總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳和紫外可見分光光度計鑒定，提取的總RNA完整且純度和濃度合格。按TaKaRa逆轉錄試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按PCR試劑盒說明進行PCR擴增。引物序列：miR-122-5p上游引物5′-CCGCTCGAGTTCGTGGCTACAGAGTTT-3′、下游引物5′-CCGGAATTCTTTATCGAGGGAAGGATT-3′，內參U6上游引物5′-CTTTTCTCCGGAACACAGATTTC-3′、下游引物5′-GATTTGCCAAGTGGGAGGGA-3′；CREB1 mRNA上游引物5′-CGCGGATCCAAATGGACTGGCTTGG-3′、下游引物5′-CGGAATTCTGCCCTATGGAAGAGCTG-3′，內參GAPDH上游引物5′-CACTCCTCCACCTTTGA-3′、下游引物5′-CCACCACCCTGTTGCTG-3′。PCR反應體系：cDNA模板2 μL，上下游引物各1.5 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL(miR-122-5p)；cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL(CREB1 mRNA)。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性15 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s共40個循環(miR-122-5p)；95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s、62 ℃退火35 s、72 ℃延伸30 s共40個循環(CREB1 mRNA)。PCR擴增反應結束后進行熔解曲線分析，收集循環閾值(CT)數。以U6或GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算miR-122-5p、CREB1 mRNA相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者出院后通過門診復查或電話形式定期隨訪3年，隨訪截至2021年3月，統計術后3年總生存率。

2 結果

2.1 食管癌組織與癌旁正常組織miR-122-5p、CREB1 mRNA表達比較 食管癌組織與癌旁正常組織miR-122-5p 相對表達量分別為0.346±0.068、0.953±0.250，CREB1 mRNA相對表達量分別為3.488±0.993、1.419±0.477。食管癌組織miR-122-5p 相對表達量明顯低于癌旁正常組織，CREB1 mRNA相對表達量明顯高于癌旁正常組織(t分別為-22.481、18.004，P均<0.01)。

2.2 食管癌組織miR-122-5p表達與CREB1 mRNA表達的關系 Pearson相關分析顯示，食管癌組織miR-122-5p 表達與CREB1 mRNA表達呈負相關關系(r=-0.562，P<0.01)。

2.3 食管癌組織miR-122-5p、CREB1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系 見表1。

表1 食管癌組織miR-122-5p、CREB1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系

2.4 食管癌組織miR-122-5p、CREB1 mRNA表達與患者預后的關系 截至2021年3月，共隨訪3～36個月，中位隨訪時間21個月，隨訪期間死亡38例。以食管癌組織miR-122-5p相對表達量的均數為臨界值，將患者分為miR-122-5p高表達者(≥0.346，44例)與低表達者(<0.346，48例)，miR-122-5p高表達者與低表達者術后3年總生存率分別為70.45%(31/44)、47.92%(23/48)，miR-122-5p高表達者術后3年總生存率高于miR-122-5p低表達者(χ2=7.327，P<0.01)；以食管癌組織CREB1 mRNA相對表達量的均數為臨界值，將患者分為CREB1 mRNA高表達者(≥3.488，42例)與低表達者(<3.488，50例)，CREB1 mRNA高表達者與低表達者術后3年總生存率分別為45.24%(19/42)、70.00%(35/50)，CREB1 mRNA高表達者術后3年總生存率低于CREB1 mRNA低表達者(χ2=7.582，P<0.01)。見圖1、2。

圖1 食管癌組織不同miR-122-5p表達者術后3年生存曲線

圖2 食管癌組織不同CREB1 mRNA表達者術后3年生存曲線

2.5 食管癌患者預后的影響因素分析 以食管癌患者預后(死亡=1，存活=0)為因變量，以性別(男=1，女=0)、年齡(≥60歲=1，<60歲=0)、病理分型(腺癌=1，鱗癌=0)、腫瘤直徑(≥4 cm=1、<4 cm=0)、組織分化程度(低分化=1，中高分化=0)、TNM分期(Ⅲ、Ⅳ期=1，Ⅰ、Ⅱ期=0)、淋巴結轉移(有=1，無=0)、miR-122-5p表達(≥0.346=1、<0.346=0)、CREB1 mRNA表達(≥3.488=1、<3.488=0)為自變量，納入Cox比例風險回歸模型，結果發現TNM分期Ⅲ、Ⅳ期及有淋巴結轉移、CREB1 mRNA表達≥3.488為食管癌患者預后不良的獨立危險因素，而miR-122-5p表達≥0.346為其獨立保護因素(P均<0.05)。見表2。

表2 食管癌患者預后的Cox比例風險回歸分析結果

3 討論

食管癌是一種起源于食管黏膜上皮的惡性腫瘤。我國是食管癌的高發國家之一，據統計，2020年我國食管癌新發病例和死亡病例分別為32.4萬例、30.1萬例[8]。由于早期癥狀不典型，大多數食管癌患者就診時已進展至晚期，而對于晚期食管癌只能采取化療、放療、分子靶向治療等，但治療效果欠佳，5年生存率僅20%～30%[9]。目前，食管癌的發病機制尚不完全清楚。因此，探索食管癌發生、發展的分子機制對其早期診斷和靶向治療具有重要意義。

非編碼RNA是一類不編碼蛋白的RNA，包括miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA等，雖然不編碼蛋白，但能夠在RNA水平上發揮多種生物學功能。miRNA是人體內廣泛分布的內源性非編碼RNA，長度一般為21～23個核苷酸，能夠通過與mRNA相互作用，降解mRNA或抑制mRNA翻譯，從而調控靶基因表達。有研究報道，miRNA能夠調控多種癌基因或抑癌基因表達，從而參與食管癌的發生、發展[10]。miR-122-5p為miRNA家族成員之一，定位于人染色體18q21.31。作為肝臟的特異性miRNA之一，miR-122-5p最初多用于肝臟疾病的早期診斷和病情評估。YANG等[11]研究報道，miR-122-5p能夠通過抑制連環蛋白δ2抑制肝癌細胞侵襲和遷移。WANG等[12]研究發現，miR-122-5p能夠通過負向調控M2型丙酮酸激酶促進腎癌細胞增殖和遷移。以上研究表明，miR-122-5p在不同腫瘤中發揮的作用亦不相同。本研究結果顯示，食管癌組織miR-122-5p相對表達量明顯低于癌旁正常組織，并且其表達與TNM分期、淋巴結轉移有關，提示miR-122-5p可能作為抑癌基因參與食管癌的發生、發展。陳劭賡等[13]將miR-122-5p mimic轉染食管癌EC109細胞后發現，EC109細胞增殖能力降低、凋亡比例升高，從細胞水平上佐證了miR-122-5p能夠參與食管癌的發生、發展。進一步研究發現，miR-122-5p高表達者術后3年總生存率高于miR-122-5p低表達者，并且miR-122-5p高表達為食管癌患者預后的獨立保護因素。提示miR-122-5p表達與食管癌預后有關，其表達越低，患者預后越差。

CREB是一種選擇性結合CREs的核蛋白，因能刺激基因轉錄，又被稱為轉錄增強因子。活化的CREB可參與多種信號傳導過程，能夠調控細胞增殖、分化、凋亡等生物學行為[14]。CREB1作為CREB家族中的一員，定位于人染色體2q32-34，可異常啟動腫瘤相關基因轉錄，通過調控具有細胞增殖、分化、凋亡等功能的靶基因表達，參與腫瘤細胞的惡性生物學行為。有研究報道，CREB1能夠參與卵巢癌、非小細胞肺癌等實體腫瘤的發生、發展[15-16]。本研究結果發現，食管癌組織CREB1 mRNA表達明顯高于癌旁正常組織，并且其表達與TNM分期、淋巴結轉移有關，提示CREB1能夠參與食管癌的發生、發展，其機制可能與CREB1異常啟動腫瘤相關基因轉錄，從而促進食管癌細胞增殖、分化、遷移等有關。進一步研究發現，CREB1 mRNA高表達者術后3年總生存率低于CREB1 mRNA低表達者，CREB1 mRNA高表達為食管癌患者預后不良的獨立危險因素。提示CREB1 mRNA表達與食管癌預后有關，其表達越高，患者預后越差。

有研究報道，在膀胱癌、結腸癌中miR-122能夠通過靶向調控CREB1參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等[17-18]。陳劭賡等[13]通過雙熒光素酶報告基因實驗證實，miR-122-5p能夠靶向負調控CREB1抑制食管癌細胞的生長和增殖。提示在食管癌中miR-122-5p與CREB1存在靶向調控關系。本研究結果顯示，食管癌組織miR-122-5p表達與CREB1 mRNA表達呈負相關關系，二者可能共同參與食管癌的發生、發展。但miR-122-5p是否通過靶向調控CREB1參與食管癌患者預后尚不清楚，還需進一步研究。

綜上所述，食管癌組織miR-122-5p表達下調、CREB1 mRNA表達上調，二者表達變化與TNM分期、淋巴結轉移以及患者預后有關。但本研究樣本量較小且隨訪時間較短，其結論還有待于進一步驗證。