小分子藥物T-5224 對多種小鼠銀屑病模型作用效果的研究

王麗，趙銳，張秋芳

1.淄博市食品藥品檢驗研究院，山東 淄博 255000；2.天津國際生物醫藥聯合研究院，天津 300457

銀屑病又名牛皮癬，該疾病是一種臨床上比較常見的皮膚病，具有發病慢、病程久、易復發等特點［1］。臨床表現主要為起初患者局部皮膚上出現少量的紅色丘疹或斑丘疹，之后丘疹的分布范圍逐漸擴大，甚至擴大到包括軀干、四肢、膝蓋、頭皮等全身各處皮膚［2］。

目前T-5224（見圖1）正作為一種治療類風濕性關節炎的藥物在美國進入臨床試驗。該化合物是基于X-射線晶體結構并借助藥效團3D 模型（見圖2），設計合成出的c-fos/AP-1 的體內抑制劑［3］。該藥物通過對c-Fos/AP-1 與DNA 結合活性的抑制，從而對基質金屬蛋白酶（MMP）的活性產生影響并可有效降低機體內多種炎癥因子的含量［4-6］。通過探討T-5224 對膠原誘導的Ⅱ型關節炎小鼠模型及對體外滑膜細胞與軟骨細胞的作用發現T-5224 可以有效降低血清、關節及細胞培養液中炎性細胞因子、基質金屬蛋白的含量［7］；也能夠降低急性肝損傷模型小鼠血清中腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1β、白介素6（IL-6）的含量而促進抗炎細胞因子白介素10（IL-10）的釋放［8］。有研究發現由于Cx31 蛋白缺失導致銀屑病發生的分子機制［9］，而T-5224 可以通過選擇性抑制c-Fos/c-Jun 信號通路而增加Cx31 蛋白的表達，可有效減輕銀屑病的病癥，而達到治療該病的目的。

圖1 T-5224 的化學結構式

圖2 AP-1 小分子抑制劑的藥效團3D模型

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康BALB/C 小鼠152 只，雌性，8～11 周齡，由北京軍事醫學科學院實驗動物中心提供，合格證號：NO.0006548。將小鼠飼養在屏障環境中，給予正常小鼠飼料與滅菌水飼養。

1.2 主要試劑及儀器

T-5224（由天津國際生物醫藥聯合研究院藥物合成組提供，純度：98.9%）；麗科杰咪喹莫特乳膏（湖北科益藥業股份有限公司，批號：120710）；醫用白凡士林（南京特納斯生物技術開發有限公司，批號：20180130）；陽性對照藥物方希阿維A膠囊（重慶華邦制藥有限公司，規格：10 mg/粒，生產批號：2018028）；己烯雌酚（廣州市漢普醫藥有限公司，生產批號：121006，純度＞99.2%）；小鼠TNF-α ELISA 檢測試劑盒（柏卡生物有限公司，批號：20130201A）；小鼠白介素-10 ELISA 檢測試劑盒（柏卡生物有限公司，批號：20130212A）。

全自動全封閉組織脫水機（型號：Leica ASP200S）；石蠟包埋機（型號：Leica EG1150H）；半自動輪轉式切片機（型號：Leica RM2245）；半自動輪轉式切片機（型號：Leica RM2245）；全自動染色機（型號：Leica Autostainer XL）；全自動玻片封片機（型號：Leica CV5030）。

1.3 咪喹莫特誘導小鼠銀屑病模型的建立

將去毛后的小鼠根據體質量的不同進行隨機分組，分為空白對照組、模型組、陽性對照藥阿維A組、陰性對照組、實驗藥物T-5224（30 mg/kg）低劑量組、實驗藥物T-5224（300 mg/kg）高劑量組，共6 組，每組8 只。除空白對照組外，用玻璃棒將5%咪哇莫特乳膏涂抹于其他各組小鼠背部，涂抹劑量為62.5 mg，1 次/d，連續8 d。在建模的同時對各組實驗小鼠進行分別給藥，給藥的方式為灌胃。空白對照組、模型組小鼠給予0.9%生理鹽水；陰性對照組給予1%聚維酮（PVP30）溶液；陽性對照組給予阿維A 混懸液；T-5224 低、高劑量組分別給予T-5224（30 mg/kg）、T-5224（300 mg/kg）。給藥的容積均為10 mL/kg 體質量，1 次/d，連續給藥8 d。

1.4 小鼠皮損PASI 評分

銀屑病樣皮損面積和疾病嚴重程度（PASI）評分標準自提出以來一直作為評價某種藥物對銀屑病治療效果的金標準被廣泛應用［10］。各部分的評分標準如下：根據紅斑由無到有，顏色由淺到深，斑塊由大到小，得分為0～4 分；鱗屑從無到有、從小到大、從局部覆蓋到全部覆蓋，得分為0～4 分；根據斑塊從無到有，從薄到厚，從微隆起到明顯隆起，得分為0～4 分。根據皮膚受損部位的嚴重情況相應的打分。將以上各個指標的得分進行加權，得到最終的PASI 評分。寫出PASI 總分算法。

1.5 小鼠血清中TNF-α、IL-10 含量的測定

通過小鼠眼眶后靜脈采血方式，每只小鼠采血0.5 mL，使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后離心分離得血清。操作步驟分別按照小鼠TNF-α、IL-10 ELISA 檢測試劑盒說明書進行，在450 nm 波長下測定各孔的OD 值。在Excel 工作表中，以標準濃度作橫坐標，對應OD 值作縱坐標，繪制出標準曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

1.6 制作組織切片、HE 染色、小鼠皮膚組織學Baker 評分及表皮厚度測量

取材及固定：采用頸椎脫位的方法將小鼠處死，分別從上、中、下三個部位取其背部皮膚，大小約為1.5 cm×0.5 cm，并將剪取的組織立即置于10%的甲醛溶液中固定處理，固定的時間約24 h。制成石蠟切片利用中性樹膠進行封片觀察。

在400 倍視野下進行組織學觀察，并拍攝圖片。從每張組織切片中隨機選取3 個較清晰視野作為Baker 組織學評分的目標。分別取每張切片的上、中、下三部分，每部分選擇六個點測量表皮層的垂直厚度。

1.7 傳統天然小鼠銀屑病模型的建立

1.7.1 小鼠陰道上皮細胞有絲分裂增快模型 將實驗小鼠隨機分成空白對照組、模型組、陰性對照組、陽性對照藥阿維A 組、實驗藥物T-5224 高劑量（30 mg/kg）組、T-5224 中劑量（10 mg/kg）組、T-5224低劑量（1 mg/kg）組，共7 組，每組8 只。空白組注射生理鹽水除空白對照組外，其他各組小鼠進行腹腔注射己烯雌酚，劑量為0.2 mg/只，給藥頻率為1 次/d，給藥時間連續3 d，使小鼠均處于動情期，3 d 后進行隔天注射，注射劑量不變，直到第12 天。除空白對照組外，其他各組小鼠從第4 天起分別進行灌胃給藥，分別給予生理鹽水、1%PVP 溶液、阿維A（10 mg/kg）、T-5224（30 mg/kg）、T-5224（10 mg/kg）、T-5224（1 mg/kg），給藥容積10 mL/kg 體質量，1 次/d，連續8 d。在實驗進行的第12 天，所有小鼠均采取腹腔注射的方式，注射秋水仙堿，劑量為2 mg/kg。6 h 后采用脫椎的方式，將所有小鼠處死，立即取出小鼠陰道組織，進行石蠟切片的制作。在光學顯微鏡下，計數有絲分裂指數。

1.7.2 計數小鼠尾鱗片表皮顆粒層 將實驗小鼠隨機分成空白對照組、陰性對照組、陽性對照藥阿維A組及實驗藥物T-5224 高劑量（30 mg/kg）組、T-5224中劑量（10 mg/kg）組、T-5224 低劑量（1 mg/kg）組，共6 組，每組8 只。除空白對照組給予生理鹽水外，其他各組小鼠采取灌胃給藥的方式，分別給予1% PVP 溶液、阿維A（10 mg/kg）、T-5224（30 mg/kg）、T-5224（10 mg/kg）、T-5224（1 mg/kg），給藥容積10 mL/kg 體質量，1 次/d，連續21 d。在第22天采用頸椎脫位方式將小鼠處死，取尾部皮膚，進行石蠟切片的制作，在光學顯微鏡下計數各組每只小鼠尾部表皮100 個鱗片中含有顆粒層的數量。

1.8 統計學方法

實驗數據采用SPSS 20.0 統計軟件進行分析，組間分析采用方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 T-5224 對咪喹莫特誘導小鼠銀屑病模型的影響

2.1.1 T-5224 有效抑制小鼠銀屑病樣炎癥反應 與空白對照組相比，其他各組在涂抹咪喹莫特2 d 左右，小鼠皮膚均開始表現出鱗屑、紅斑及增厚浸潤。但陽性藥物在給藥的前3 d，均可有效控制皮損程度，將PASI 評分控制在較低的水平。但隨著涂抹咪喹莫特建模時間的延長，陽性藥物對皮損的抑制程度減弱。在建模的5～7 d 除空白對照組外的各組小鼠皮損表現最為嚴重，紅斑面積增大、鱗屑增多、浸潤程度嚴重，皮膚受損情況類似于銀屑病病癥。但是受試藥物T-5224 低劑量組、高劑量組均可將PASI 皮損評分控制在較低的水平。與陰性對照組、溶劑組、甚至陽性藥物組相比皮損癥狀較輕，皮膚相對較光滑、鱗屑較少、紅斑及浸潤程度也相對較輕，且T-5224 低劑量組皮損的治療情況較高劑量組明顯，見圖3，圖4。

圖3 各組小鼠在建模并給藥8 d后背部皮膚情況

圖4 各組小鼠紅斑、鱗片、皮損厚度及PASI評分情況

2.1.2 T-5224 對模型小鼠背部皮膚病理組織學影響 從病理學切片圖可以看出，模型組與空白對照組相比表皮層增厚，透明細胞層與顆粒細胞比例增大，真皮炎細胞浸潤，以淋巴細胞為主，汗腺萎縮，汗毛孔增大，局部可見炎性滲出，皮下毛細血管充血，脂肪細胞萎縮，表皮纖維瘢化。陰性對照組小鼠背部皮膚組織切片情況類似模型組；陽性藥物組有炎性滲出物，角化程度略有減輕，透明細胞比例減少，顆粒細胞、基底細胞增多、增大且胞核變淺，表皮外層偶可見分裂相，汗毛孔基質細胞增生旺盛，汗腺異常，脂肪細胞萎縮同模型組，毛細血管充血情況有所改善，淋巴細胞的浸潤程度較模型組要低。T-5224 低劑量組表皮層變薄，角化程度稍見好轉，透明細胞數減少，基底細胞增殖程度下降，汗腺可見較明顯的再生，脂肪層有所增厚，毛細血管浸潤程度也明顯減弱，仍存在少量淋巴細胞浸潤現象；T-5224 高劑量組，表皮略呈現剝落壞死，脂肪層嚴重萎縮，皮下纖維組織可見壞死癥，未見基底細胞增殖，也可見毛細血管充血，見圖5。通過小鼠皮膚組織學Baker 評分統計30 mg/kg T-5224 組小鼠模型組小鼠相比差異有統計學意義，見表1。病理切片結果可部分反應，低劑量的T-5224 具有抑制上皮細胞角化、抗炎、促使表皮及真皮層組織結構正常化等特點，但藥物過量可能會引起全身系統反應。

圖5 各組小鼠背部皮膚組織切片（HE×400）

2.1.3 T-5224 對模型小鼠血清中TNF-α、IL-10 含量的影響 研究發現通過涂抹咪喹莫特誘導建模后，模型組小鼠血清中TNF-α 的含量明顯較空白對照組升高，低劑量（30 mg/kg）、高劑量（300 mg/kg）及陽性藥物阿維A 均可有效降低銀屑病模型小鼠血清中TNF-α 的含量，同時均可有效升高銀屑病模型小鼠血清中IL-10 的含量（P＜0.05），見表1。

表1 Baker 評分及小鼠血清中TNF-α和IL-10的濃度（）

表1 Baker 評分及小鼠血清中TNF-α和IL-10的濃度（）

注：與模型組比較，aP＜0.05。

2.2 T-5224 對傳統小鼠銀屑病模型的影響

2.2.1 T-5224 對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂的影響通過不同濃度的T-5224 對雌激素刺激下的小鼠陰道上皮細胞有絲分裂抑制情況的研究發現，低劑量（1 mg/kg）的T-5224 對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂的抑制情況差異無統計學意義。當T-5224 濃度達到10 mg/kg 時，則對有絲分裂指數產生較明顯影響，當T-5224 濃度達到30 mg/kg 時，對有絲分裂指數的影響最明顯，且與中劑量組相比差異有統計學意義，而與陽性藥物組相比差異無統計學意義，說明T-5224 的給藥濃度達到30 mg/kg 時，對細胞的過度增殖抑制作用最強，可有效針對銀屑病角質細胞過度增殖這一特點，見圖6，表2。2.2.2 T-5224 對小鼠尾鱗片顆粒層細胞形成數的影響 給予不同藥物21 d 后，通過對各組小鼠尾鱗片顆粒層細胞形成數的分析發現，空白對照組及陰性對照組小鼠尾鱗片顆粒層細胞數均較少，且兩組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。陽性對照藥物組，T-5224 低、中、高劑量組顆粒層細胞數均呈現不同程度的增加，且與空白對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。統計結果表明陽性藥物組顆粒層細胞數目最多（圖7，表2）。隨著T-5224 濃度的升高促進作用逐漸增強；當T-5224 達到較高劑量（30 mg/kg）時，其促進作用與陽性藥物相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖6 各組小鼠陰道組織切片（HE×1000）

圖7 各組小鼠尾部皮膚組織切片（HE×1000）

表2 各組小鼠陰道上皮細胞有絲分裂指數及尾鱗片顆粒層形成數（）

表2 各組小鼠陰道上皮細胞有絲分裂指數及尾鱗片顆粒層形成數（）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與空白對照組比較，bP＜0.05。

3 討論

由于銀屑病只可在人類與靈長類動物中自發形成，所以缺少銀屑病相關模型，從而阻礙了對該病發病機制與治療的研究進展［11］。在選擇合適的受試動物的基礎上，成功建立銀屑病模型，是研究銀屑病機制與治療的關鍵。雖然小鼠皮膚與人的皮膚存在一定的差異，如小鼠表皮厚度較薄、皮膚毛囊數量較多、真皮較薄，不利于瘢痕的形成等［12］。但是，近些年研究發現，利用小鼠作為受試動物建立的銀屑病模型可以較準確而全面地反映銀屑病的發病特征。本研究選用了咪喹莫特乳膏誘導的銀屑病樣小鼠模型與傳統天然模型相結合的方式探討了T-5224 對銀屑病的治療作用和量效關系，為T-5224用于銀屑病的治療提供了理論基礎。將來可以運用免疫組化、細胞培養等技術并結合部分生化指標及多種銀屑病相關細胞因子的檢測［13-15］，使該研究進一步深化。