排石顆粒高效液相色譜法指紋圖譜研究及薄層色譜鑒別

李柯城，袁銘銘，熊曉麗，周國平

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

排石顆粒由連錢草、石韋、木通、鹽車前子、徐長卿、忍冬藤等十味藥組成。具有排石通淋、清熱的作用，臨床主要作用于腎結石和尿路結石，療效良好［1-3］。排石顆粒收載于《中國藥典》（2020年版一部），但質量標準相對較低，不能全面控制排石顆粒的質量。且排石顆粒指紋圖譜相關的報道較少，色譜峰指認及歸屬不全，鑒別方法單一［4-8］。因此本研究收集了15 個不同批次的排石顆粒，建立了高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜，確立了25 個共有峰，指認了咖啡酸、綠原酸、4,5-二咖啡酰基奎寧酸酯、1,2-二咖啡酸-環戊基-3-醇、迷迭香酸5 個化學成分，歸屬了12 個未知峰。同時建立了排石顆粒中木通成分akemisaponin E、皂苷 PJ1 的薄層色譜（TLC）鑒別［9-10］。為排石顆粒質量評價方面提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Scientific Ultimate3000 系列高效液相色譜儀，Chromeleon 7 工作站，DAD 檢測器；Milli-Q Advantage A10 純水儀；KQ-500DE 超聲儀；MS205DU電子天平（十萬分之一）；ME204TE 電子天平（萬分之一）；DHG-P076A 干燥箱；HPTLC Silica gel 60 薄層板。

1.2 試藥

對照品綠原酸（批號110753-202018），對照品咖啡酸（批號110885-201703），對照品迷迭香酸（批號111871-201404），購于中國食品藥品檢定研究院。對照品1,2-二咖啡酸-環戊基-3-醇、4,5-二咖啡酰基奎寧酸酯、Akemisaponin E、皂苷PJ1 均由本課題組自制，經MS、1H-NMR 和13C-NMR 鑒定，HPLC 法檢測面積歸一化法計算純度均在98.0%以上。乙腈、甲醇為色譜純（美國Sigma 公司），水為Milli-Q 超純水，其余試劑為分析純。

15 批排石顆粒均來自江西南昌濟生制藥有限責任公司［S1～S15，批號200501（無糖型）、200114-2、191209-3、190705-2、190708-2、190706-2、190706-1、200114-2、191121-2、191111（無糖型）、210217-1、210202-1、210202-2、200715-2、200604-2］。10 味藥材樣品連錢草、木通、石韋、滑石、苘麻子、鹽車錢子、徐長卿、忍冬藤、瞿麥、甘草，經江西省藥品檢驗檢測研究院周國平主任中藥師鑒定。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液

取排石顆粒樣品5 g（無糖型1 g）精密稱定，置100 mL 具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL。稱定重量，超聲（頻率60 kHz，溫度25 ℃）30 min，取出放冷，50%甲醇補重，搖勻，過濾，濾液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2 混合對照品溶液

稱取咖啡酸對照品，綠原酸對照品，迷迭香酸對照品，4,5-二咖啡酰基奎寧酸酯，1,2-二咖啡酸-環戊基-3-醇對照品適量，精密稱定，加適量50%甲醇稀釋成濃度分別為0.118、0.131、0.117、0.220、0.124 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.3 陰性樣品溶液

按《中國藥典》（2020年版一部）排石顆粒處方稱取藥材，按制法制備10 份空白溶液（分別缺連錢草、缺木通、缺石韋、缺滑石、缺苘麻子、缺鹽車錢子、缺徐長卿、缺忍冬藤、缺瞿麥、缺甘草），再按“2.1”項下制備陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件

Thermo Scientific C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇∶乙腈（1∶1，v/v）（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫，見表1。體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長284 nm。

表1 流動相梯度洗脫表

2.5 排石顆粒指紋圖譜方法學

2.5.1 精密度試驗 取排石顆粒樣品（S1）約1 g，按“2.1”項下方法制備供試品，按“2.4”項下記錄HPLC 圖譜，連續6 次測得各共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD 均小于2%。表明儀器的精密度良好。

2.5.2 重復性試驗 精密稱定排石顆粒樣品（S1）6 份，每份約1 g，按“2.1”項下方法制備供試品，按“2.4”項下記錄HPLC 圖譜，測得各共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD 均小于2%。表明儀器的重復性良好。

2.5.3 穩定性試驗 取排石顆粒樣品（S1）約1 g，按“2.1”項下方法制備供試品，置室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 后按“2.4”項下記錄HPLC 圖譜，測得各共有峰相對保留時間與相對峰面積的RSD 均小于2%，表明排石顆粒供試品在室溫下24 h 內穩定。

2.6 排石顆粒指紋圖譜的建立

2.6.1 參照峰的選擇 觀察HPLC 圖譜，發現相對于其他色譜法而言，25 號色譜峰（迷迭香酸）的峰形較好、峰面積較大，且出峰時間較穩定穩定，故作為參照峰。2.6.2 對照指紋圖譜和共有指紋峰的標定 取各批次排石顆粒樣品，按“2.1”項下制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件記錄圖譜，將HPLC 圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A 版）進行峰匹配，采用多點校正法并生成對照圖譜，共標示出25 個共有峰，建立了15 批排石顆粒的疊加指紋圖譜，見圖1。生成排石顆粒的共有指紋圖譜，見圖2。

圖1 15 批排石顆粒的HPLC指紋圖譜

圖2 排石顆粒HPLC指紋圖譜共有指紋圖譜

2.7 相似度計算

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004版）軟件計算指紋圖譜相似度，結果顯示15 批排石顆粒相似度均大于0.952，見表2。說明不同批次間排石顆粒整體類似，產品質量穩定。

表2 15 批排石顆粒相似度結果

2.8 主要色譜峰的指認及歸屬

取陰性樣品溶液，按“2.4”色譜條件記錄圖譜，根據對照品的保留時間、DAD 光譜圖，以及混合對照品溶液、對照品溶液、供試品溶液、各陰性樣品溶液的HPLC 圖譜進行分析比較，指認出5 個主要色譜峰，如圖3所示。對部分色譜峰進行指認及歸屬，見表3 所示。

圖3 混合對照品HPLC色譜圖

表3 色譜峰歸屬結果

2.9 排石顆粒的TLC 鑒別

2.9.1 供試品的制備 稱取排石顆粒樣品20 g（無糖型5 g）置圓底燒瓶內，加水飽和正丁醇200 mL，加熱回流1 h，室溫下放冷，濾過，濾液加氨試液洗滌3 次（每次100 mL），棄去氨試液層，加正丁醇飽和的水液洗滌2 次（每次20 mL），棄去水層，正丁醇層蒸干，殘渣加甲醇1 mL 溶解，得供試品溶液。

2.9.2 對照品的制備 稱取對照品Akemisaponin E、皂苷PJ1 適量，加甲醇制成濃度分別為2 mg/mL，1 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.9.3 陰性對照的制備 照《中國藥典》（2020年版一部）排石顆粒制法制備陰性對照（缺木通），稱取5 g 陰性對照干品置圓底燒瓶內，與供試品溶液同法操作，得陰性對照溶液。

2.9.4 TLC 測定方法 照《中國藥典》（2020年版四部附錄）薄層色譜法［11］試驗，吸取供試品溶液、陰性對照溶液以及混合對照品溶液各10 μL，點于同一塊HPTLC Silica gel 60薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（15∶9∶1）為展開系統，展開，取出，晾干，立即噴以10%硫酸乙醇顯色劑，置105 ℃加熱至斑點清晰，日光檢視。結果顯示供試品與混合對照品在相應位置上顯相同顏色的斑點，而陰性樣品無干擾，結果如圖4 所示。

圖4 排石顆粒木通陰性薄層色譜圖

2.10 TLC 耐用性考察

薄層板的比較：考察了德國制HPTLC Silica gel 60硅膠G 板與青島海洋化工制硅膠G 板的分離效果，結果表明兩種不同品牌的薄層板對斑點的分離效果無明顯差異。濕度的比較：控制溫度為26 ℃，考察低濕（RH=20%）、常濕（RH=55%）、高濕（RH=75%）下的分離情況。結果表明，三種濕度條件下斑點的分離效果無明顯差異。溫度的比較：控制濕度為RH=55%，考察常溫（T=26 ℃）和低溫（T=8 ℃）下的分離情況。結果表明，常溫和低溫條件下分離效果無明顯差異。

3 討論

3.1 指紋圖譜提取方式的考察

本實驗考察了超聲提取（頻率60 kHz，溫度25 ℃）和回流提取兩種方式，結果顯示超聲提取更完全；同時考察了無水乙醇、30%乙醇、50%乙醇，70%乙醇、甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇提取溶劑，結果發現用50%甲醇提取時，色譜峰較高，峰數量較多；提取時間考察了15 min，30 min和45 min，結果表明30 min 和45 min 提取效果接近，所以最終選擇超聲提取30 min。

3.2 HPLC 色譜條件的考察

本實驗流動相組成考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇∶乙腈（1∶1）-0.1%磷酸水，結果顯示以甲醇∶乙腈（1∶1）-0.1%磷酸水為流動相時基線平穩，峰型較好；柱溫考察了20 ℃、30 ℃和40 ℃，結果表明在30 ℃時，排石顆粒供試品色譜圖各峰分離效果最佳；色譜柱考察 了SHIMADZU C18、OSAKA SODA C18 和Thermo Scientific C18 三個不同品牌的色譜柱進行分析。結果表明Thermo Scientific 色譜柱的分離效果較好。

3.3 TLC 條件考察

展開劑考察了三氯甲烷-甲醇-甲酸（15∶10∶1）、三氯甲烷-甲醇-甲酸（12∶9∶1）、三氯甲烷-甲醇-甲 酸（15∶9∶1）、正 丁 醇-甲 醇-甲 酸（20∶10∶1）、正丁醇-甲醇-水（15∶9∶1）系統，結果顯示以三氯甲烷-甲醇-甲酸（15∶9∶1）為展開劑效果最佳，展開時間短，分離效果好；顯色劑考察了10%硫酸乙醇試液、5%硫酸香草醛試液，結果顯示10%硫酸乙醇試液顯色效果較好。

4 小結

本實驗建立了排石顆粒HPLC 指紋圖譜，并對江西南昌濟生制藥有限公司的15 批排石顆粒進行定性分析，結果表明15 批排石顆粒未見明顯差異。建立了排石顆粒中akemisaponin E、皂苷PJ1的TLC 鑒別，結果表明斑點清晰。本方法可用于定性評價排石顆粒的質量，對進一步完善排石顆粒質量評價方法提供參考依據。