細(xì)毛羊細(xì)管冷凍精液制作技術(shù)研究

文│唐淑紅 吳建 李鳳珍（新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇地區(qū)畜牧技術(shù)推廣中心）

中國美利奴（新疆型）細(xì)毛羊的羊毛產(chǎn)量和質(zhì)量已達(dá)到國際同類細(xì)毛羊的先進(jìn)水平。德國美利奴細(xì)毛羊?qū)儆谌饷嬗眉?xì)毛羊具有生長育速度快、成熟早、產(chǎn)肉率高、肉質(zhì)好、被毛白而長、品質(zhì)好等優(yōu)良特性，是細(xì)毛羊中優(yōu)秀的品種。精液冷凍保存技術(shù)可使優(yōu)質(zhì)種羊精液不受時間與空間限制，對實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種遺傳資源傳承有著重要的意義。自1949年來甘油被英國科學(xué)家用于冷凍精液保存并取得較好成效，隨后精液冷凍技術(shù)不斷發(fā)展，綿羊精液冷凍效果有所提升，但冷凍效果受地區(qū)、物種、品種等不同因素的影響，特定地區(qū)的綿羊精子冷凍稀釋液配方及制作方法還需進(jìn)一步完善。

一、材料

1.試驗(yàn)動物。選擇品種特征明顯、生長發(fā)育良好、性欲較強(qiáng)、身體健康的中國美利奴（新疆型）細(xì)毛羊和德國美利奴細(xì)毛羊的種公羊各5只作為采精公羊。

2.試驗(yàn)器材。半自動精液分裝機(jī)（KHF labopart），顯微鏡（顯峰XSP-6C-1600X），數(shù)顯恒溫水浴鍋（金威HH-1）。

3.試驗(yàn)藥品。葡萄糖、檸檬酸鈉、檸檬酸藥品為分析純，購自天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；甘油購自天津永晟精細(xì)化工有限公司；卵黃來源于市場的新鮮雞蛋；CASSOU吸管0.25毫升；CASSOU封口粉等。

4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差分析檢驗(yàn)差異顯著性。

二、方法

1.采精與品質(zhì)鑒定。在試驗(yàn)開始前1個月左右對選取的種公羊進(jìn)行適當(dāng)補(bǔ)飼、強(qiáng)化管理。采精時選擇發(fā)情母羊作為臺羊，使用假陰道法采集精液，采精量0.5～2毫升/只。先選擇乳白色、略帶腥味、無雜質(zhì)的精液；再試驗(yàn)室測定原精活力、密度。

2.不同稀釋液對比。依照表1所示，配制不同卵黃濃度的稀釋I液和不同甘油濃度的稀釋II液，分別組合成1、2、3、4、5號稀釋冷凍液。根據(jù)精液密度，用I液第一次稀釋，4℃平衡2小時；用等量II液第二次稀釋，再4℃平衡2小時；選取精子活力≥0.6的精液進(jìn)行冷凍。熏蒸方法如上文所述；采用濕解凍法，從液氮中取出一支細(xì)管凍精在空氣中晃動10秒，投入42℃水浴中并晃動20秒，擦干后進(jìn)行活力檢測。

3.不同熏蒸方式對比。經(jīng)過稀釋、平衡的精液，采取不同的熏蒸時間和距離液氮高度調(diào)節(jié)降溫速率進(jìn)行降溫。方式一采取距離液氮4厘米，熏蒸7分鐘；方式二采取距離液氮7厘米，熏蒸6分鐘；方式三采取距離液氮7厘米，熏蒸7分鐘；方式四采取距離液氮7厘米，熏蒸8分鐘，隨后將細(xì)管凍精投入液氮中。

三、結(jié)果與分析

1.對比分析中國美利奴（新疆型）細(xì)毛羊和德國美利奴細(xì)毛羊精液冷凍效果。中國美利奴（新疆型）細(xì)毛羊和德國美利奴細(xì)毛羊的原精活率、平衡后精子活率及冷凍解凍后活率差異均不顯著（P＞0.05，表2）。

2.不同稀釋液對中國美利奴（新疆型）細(xì)毛羊和德國美利奴細(xì)毛羊精液冷凍效果的分析。添加不同濃度卵黃液對中國美利奴（新疆型）細(xì)毛羊 精液冷凍解凍效果的影響，如表3所示，10%卵黃液添加組效果最好，且與15%和20%卵黃液添加組差異顯著（P＜0.05），15%與20%卵黃液添加組間差異不顯著（P＞0.05）。如表4所示，6%甘油添加組效果最好，且與7%和8%甘油添加組差異顯著（P＜0.05），7%與8%甘油添加組間差 異不顯著（P＞0.05）。

表1 冷凍稀釋液配方

表2 兩種細(xì)毛羊凍精活率分析

添加不同濃度卵黃液對德國美利奴細(xì)毛羊精液冷凍解凍效果的影響，如表5所示，10%卵黃液添加組效果較好，但卵黃液添加組間差異不顯著（P＞0.05）。如表6所示，7%甘油添加組效果最好，且與8%甘油添加組差異極顯著（P＜0.01），7%甘油添加組與6%甘油添加組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 添加不同濃度卵黃液對中國美利奴（新疆型）細(xì)毛羊凍精活率的影響

表4 添加不同濃度甘油對中國美利奴（新疆型）細(xì)毛羊凍精活率的影響

表5 添加不同濃度卵黃液對德國美利奴細(xì)毛羊凍精活率的影響

表6 添加不同濃度甘油對德國美利奴細(xì)毛羊凍精活率的影響

表7 不同熏蒸制作方式對中國美利奴（新疆型）細(xì)毛羊凍精活率的影響

表8 不同熏蒸制作方式對德國美利奴細(xì)毛羊凍精活率的影響

3.不同熏蒸制作方式對中國美利奴（新疆型）細(xì)毛羊和德國美利奴細(xì)毛羊精液冷凍效果的分析。不同熏蒸制作方式對中國美利奴（新疆型）細(xì)毛羊精子冷凍解凍后活率的影響，如表7所示，采取方式三距離液氮7厘米，熏蒸7分鐘的效果最好，且與方式四距離液氮7厘米，熏蒸8分鐘差異顯著（P＜0.05），其他熏蒸制作方式差異不顯著（P＞0.05）。

不同熏蒸制作方式德國美利奴細(xì)毛羊精子冷凍解凍后活率的影響，如表8所示，采取方式三距離液氮7厘米，熏蒸7分鐘的效果最好，且與方式四距離液氮7厘米，熏蒸8分鐘差異極顯著（P＜0.01）；方式二距離液氮7厘米，熏蒸6分鐘方式四距離液氮7厘米，熏蒸8分鐘差異顯著（P＜0.05）；其他熏蒸制作方式差異不顯著（P＞0.05）。

四、討論

卵黃作為營養(yǎng)物質(zhì)的一種，能為精子的代謝提供能量，還能增強(qiáng)精子抗低溫的能力。Cardoso等研究表明在哺乳動物精液稀釋液中添10%～20%的卵黃效果最佳，與本次試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

甘油作為廣泛使用的精子冷凍保護(hù)劑，具有滲透性，在低溫下使細(xì)胞脫更多的水，阻礙冰晶的形成，提高冷凍精子的成活率。但也具有一定的毒副作用，因此在不影響冷凍效果的基礎(chǔ)上，需盡量降低甘油濃度。胡建宏等表明雖然添加7%和8%甘油濃度也有益于凍精活力，但添加6%的甘油效果最好。與本次試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

精液冷凍結(jié)果易受個體以及稀釋液成分等因素的影響，因此精液冷凍降溫時間和降溫速度也有所不同。本試驗(yàn)通過四種方式的對比，結(jié)果顯示距離液氮7厘米，熏蒸7分鐘的效果最好，最適用于本次試驗(yàn)羊冷凍解凍后精子活力的復(fù)蘇。