青蝦復配天然保鮮劑配方優化

黃昊，何涓源，賴思婷，嚴兆蘭，馮艷麗，余翔*

（1.浙江恒通生物科技股份有限公司，浙江 湖州 313014；2.湖北師范大學生命科學學院，食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435002）

青蝦（Macrobrachium nipponense）學名日本沼蝦，其味道鮮美、營養豐富，深受消費者青睞，市場需求量逐年上升[1]，但值得關注的是，包括青蝦在內的蝦類水產品在被捕獲離水后容易死亡，且在后續加工和冷藏過程中由于微生物增殖、內源酶作用和脂質氧化等因素的影響，往往會導致新鮮蝦產品發生腐敗變質現象[2]。雖然已有的冷凍技術能夠有效地延長蝦類水產品的保藏期，但冷凍和解凍工序會對青蝦色澤、質地、風味以及持水力等感官品質造成不可逆的負面影響，極大地影響青蝦的質量和經濟性[3-4]。隨著消費者對低溫肉制品接受度的與日俱增和我國冷鏈技術的完善，如何提升新鮮青蝦的冷藏貨架期成為行業關注的熱點，眾多學者對之開展了大量研究，其中天然保鮮劑技術以其高效、安全、低成本和易實施的特點而備受關注。

近年來，隨著天然保鮮劑研究的深入，各種具有抑菌保鮮作用的天然物質正在被逐步開發應用于水產品保鮮中，取得了較好的冷藏保鮮效果。但研究同時也表明，使用單一天然保鮮劑進行食品保鮮時，往往會出現保鮮劑用量過大且保鮮效果有限的現象，根據柵欄技術的原理，將不同的天然保鮮劑進行復配，可發揮其協同效應使保鮮效果大幅提升[5]。于淑池等[6]將殼聚糖、ε-聚賴氨酸鹽酸鹽和茶多酚進行復配，對金鯧魚進行冷藏保鮮，結果表明使用復配保鮮劑處理的金鯧魚樣品的一級鮮度和貨架期均延長4 d，保鮮效果優于單獨使用殼聚糖的對照組。Na等[7]研究表明，相比單一組分涂膜，殼聚糖和賴氨酸復配涂膜對南美青蝦肌肉內以假單胞菌為代表的嗜溫菌和以硫化氫產生菌為代表的嗜冷菌生長有顯著抑制作用（P＜0.05）。趙海鵬[8]對殼聚糖、茶多酚和乳酸鏈球菌素的復配抑菌試驗結果表明，該復配保鮮劑能使菌體變形，在菌體表面形成泡狀結構，破壞細胞壁和細胞膜的結構，抑菌效果顯著。因此，本研究擬將殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素4種天然保鮮劑通過正交試驗進行配方優化，開發出復配天然保鮮劑應用于青蝦冷藏保鮮。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青蝦：浙江恒通生物科技股份有限公司養殖基地，捕撈后以鮮活狀態運輸至實驗室進行后續樣品保鮮處理；胡蘿卜：市售。

殼聚糖（脫乙酰度≥90%）、迷迭香提取物、卡拉膠、乳酸鏈球菌素（均為食品級）：河南圣斯得實業有限公司；硼酸、氧化鎂、硫酸、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

全自動凱氏定氮儀（K9860）：山東海能科學儀器有限公司；生物潔凈工作臺（BCM-1300A）：蘇凈集團安泰公司；電子天平（CP114）：美國奧豪斯儀器（上海）有限公司；pH計（PHS-3C）：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 復配保鮮劑的配制及樣品處理方法

分別稱取一定質量的殼聚糖粉末，用1%醋酸溶液溶解制成殼聚糖溶液，再將迷迭香提取物、卡拉膠和乳酸鏈球菌素分別按比例稱取并溶解至殼聚糖溶液中，攪拌均勻制成復配保鮮劑，置于4℃貯藏備用。將新鮮青蝦洗凈、瀝干，按料液比1∶2（g/mL）浸沒至復配保鮮劑中10 min，撈出置于4℃環境瀝干30 min后，分組裝入保鮮袋中置于4℃進行冷藏。

1.3.2 殼聚糖成膜濃度考察

在復配天然保鮮劑中，殼聚糖是重要的成膜材料，其成膜性好壞直接決定青蝦的保鮮效果，因此，確定殼聚糖的成膜濃度至關重要。分別配制濃度為0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%的殼聚糖溶液，分別將其涂在胡蘿卜塊表面，制備成裝片置于低倍鏡下（100倍）進行成膜性觀察。然后分別取10 mL殼聚糖溶液均勻涂布在載玻片表面，50℃烘干30 min后觀察殼聚糖在載玻片表面的成膜連續性。以蒸餾水為空白對照（CK）。

1.3.3 單因素試驗設計

采用單因素試驗，考察殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素的質量分數對涂膜處理后的青蝦在4℃冷藏3 d后保鮮效果的影響。設定復配天然保鮮劑基礎配方為殼聚糖質量分數1.5%，卡拉膠質量分數0.20%，迷迭香提取物質量分數0.06%，乳酸鏈球菌素質量分數0.06%，考察殼聚糖質量分數（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、卡拉膠質量分數（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）、迷迭香提取物質量分數（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）和乳酸鏈球菌素質量分數（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）對青蝦冷藏保鮮效果的影響。

1.3.4 復配天然保鮮劑優化

根據單因素試驗結果，以殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素的質量分數為因素，每個因素設3個水平，以貯藏3d后青蝦的揮發性鹽基氮（total volatilebasicnitrogen，TVB-N）值為參考指標，采用L9（34）正交試驗優化復配天然保鮮劑配方。因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5 揮發性鹽基氮值

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》，采用凱氏定氮法進行測定，平行測定3次。

1.4 數據處理

試驗數據采用SPSS 18.0軟件的one-way ANOVA程序進行方差分析，采用Duncan氏多重比較檢驗，結果以平均值±標準差表示，P＜0.05為差異顯著性標準。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖成膜濃度的確定

青蝦體內富含大量多酚氧化酶類，在保鮮貯藏過程中如不充分隔絕氧氣，青蝦極易發生由于酚類氧化而導致的褐變現象，造成青蝦貯藏品質的下降[9]。因此，在青蝦冷藏保鮮過程中不僅要考慮殼聚糖對青蝦體內腐敗微生物的抑菌效果，而且更要關注殼聚糖在青蝦表面成膜的效果。

不同濃度（0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%）殼聚糖溶液涂膜胡蘿卜的顯微觀察結果見圖1，成膜效果見圖2。

圖1 不同濃度殼聚糖成膜顯微觀察圖（100×）Fig.1 The microscope photo of chitosan film with different concentration（100×）

圖2 不同濃度殼聚糖成膜效果Fig.2 Theperformanceofchitosanfilmwithdifferentconcentration

圖1中，殼聚糖濃度低于1.00%時，其在胡蘿卜表面形成的膜不連續且各部位薄厚不一，成膜性較差，而殼聚糖濃度≥1.00%以上時，開始在胡蘿卜表面形成連續且薄厚均一的膜，隨著殼聚糖濃度的逐步增大，膜的厚度隨之增加。同樣，當殼聚糖濃度≥1.00%時，在玻璃載玻片上涂膜形成的殼聚糖膜連續且厚薄均一（圖2），無空缺現象。因此，可確定殼聚糖成膜濃度為1.00%。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 殼聚糖質量分數的確定

不同質量分數的殼聚糖對青蝦TVB-N值的影響見圖3。

圖3 不同質量分數的殼聚糖對青蝦TVB-N值的影響Fig.3 Effect of different concentration of chitosan on TVB-N value of shrimp

揮發性鹽基氮是動物源食品原料貯藏和加工過程中，由于體內內源酶和外界微生物的共同作用導致肌肉蛋白質分解產生氨及低級別胺類化合物，其含量高低是評判動物源食品保鮮效果的重要參數[10]。GB 2733—2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產品》[11]規定淡水魚蝦TVB-N≤20 mg/100 g。經過涂膜處理的青蝦4℃冷藏3 d后，無添加組（0%）和0.5%殼聚糖涂膜組青蝦樣品的TVB-N值分別為22.19、20.99 mg/100 g，超過20 mg/100 g的限量標準。當殼聚糖的質量分數大于0.5%后，4組試驗組（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）樣品的TVB-N值之間無明顯差異（P＞0.05），但均顯著低于空白組和0.5%殼聚糖涂膜組（P＜0.05），且均低于水產品衛生限量標準。因此，確定殼聚糖的質量分數為1.0%進行后續正交優化試驗。

2.2.2 卡拉膠質量分數的確定

不同質量分數的卡拉膠對青蝦TVB-N值的影響見圖4。

圖4 不同質量分數的卡拉膠對青蝦TVB-N值的影響Fig.4 Effect of different concentration of carrageenin on TVB-N value of shrimp

由圖4可知，無添加組（0%）、0.10%卡拉膠組和0.15%卡拉膠組的TVB-N值之間無顯著差異（P＞0.05），且均低于20 mg/100 g。當卡拉膠質量分數大于0.15%時，0.20%、0.25%、0.30%卡拉膠涂膜試驗組樣品的TVB-N值無顯著差異（P＞0.05），但均顯著低于0%、0.10%和0.15%卡拉膠試驗組（P＜0.05）。以往的研究[12-13]表明，卡拉膠能夠與其它食品膠進行復配，形成協同增效的作用來提高膜的成膜性能、凝膠強度和對被涂膜材料的黏附性等，進而提高復配保鮮劑的涂膜保鮮效果，本研究結果與之相符。因此，單因素試驗確定卡拉膠的質量分數為0.20%進行后續正交優化試驗。

2.2.3 迷迭香提取物質量分數的確定

不同質量分數的迷迭香提取物對青蝦TVB-N值的影響見圖5。

圖5 不同質量分數的迷迭香提取物對青蝦TVB-N值的影響Fig.5 Effect of different concentration of rosemary extract on TVB-N value of shrimp

由圖5可知，當迷迭香提取物質量分數≤0.06%時，4組（0%、0.02%、0.04%、0.06%）樣品間的 TVB-N值沒有顯著差異（P＞0.05），當迷迭香提取物質量分數≥0.08%時，0.08%和0.10%迷迭香提取物涂膜試驗組樣品的TVB-N值沒有顯著差異（P＞0.05），且均顯著低于其它4組的TVB-N值（P＜0.05）。迷迭香提取物富含迷迭香酸、精油和眾多酚類物質[14]，具有較好的抑菌和抗氧化特性，Ozogul等[15]用4%迷迭香精油納米乳浸泡處理虹鱒魚，虹鱒魚表面嗜冷菌生長被抑制，在2℃下貯藏期達到24 d。Shi等[16]用0.2%迷迭香提取物浸泡伍氏螻蛄蝦10 s～15 s，處理后的伍氏螻蛄蝦在-20℃冷凍條件下可以貯藏24周。本研究結果也表明復配天然保鮮劑中迷迭香提取物的添加有助于保鮮劑抗菌性能的提升。因此，單因素試驗確定迷迭香提取物的質量分數為0.08%，進行后續正交優化試驗。

2.2.4 乳酸鏈球菌素質量分數的確定

不同質量分數的乳酸鏈球菌素對青蝦TVB-N值的影響見圖6。

圖6 不同質量分數的乳酸鏈球菌素對青蝦TVB-N值的影響Fig.6 Effect of different concentration of nisin on TVB-N value of shrimp

由圖6可知，0.04%試驗組青蝦樣品的TVB-N值顯著低于無添加組和0.02%試驗組（P＜0.05），但乳酸鏈球菌素質量分數≥0.06%時，3組試驗組（0.06%、0.08%、0.10%）青蝦樣品的TVB-N值基本沒有差別（P＞0.05），但均顯著低于0.04%處理組的TVB-N值（P＜0.05）。乳酸鏈球菌素以其高效抑菌和安全特性被廣泛應用于各類食品加工和貯藏中[17-18]，本研究中乳酸鏈球菌素質量分數為0.06%時青蝦的TVB-N值低至13.83 mg/100 g，大幅低于其它單因素試驗結果，也反映出乳酸鏈球菌素對青蝦的高效抑菌保鮮效果。因此，單因素試驗確定乳酸鏈球菌素的質量分數為0.06%，進行后續正交優化試驗。

2.3 正交試驗

正交試驗結果見表2。方差分析結果見表3。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis on the results of orthogonal experiment

分析表2和表3可知，4種天然保鮮劑中，殼聚糖質量分數、卡拉膠質量分數和乳酸鏈球菌素質量分數對青蝦TVB-N值的影響顯著，其中殼聚糖質量分數和乳酸鏈球菌素質量分數影響極顯著（P＜0.01）。迷迭香提取物質量分數對青蝦TVB-N值影響不顯著（P＞0.05）。各組分對青蝦TVB-N值的影響主次順序為乳酸鏈球菌素質量分數（D）＞殼聚糖質量分數（A）＞卡拉膠質量分數（B）＞迷迭香提取物質量分數（C）。確定各因素較優水平分別為k3（A）、k1（B）、k3（C）、k3（D），以TVB-N值為指標得到青蝦復配天然保鮮劑的最佳配方組合為A3B1C3D3，即殼聚糖質量分數1.25%、卡拉膠質量分數0.175%、迷迭香提取物質量分數0.09%、乳酸鏈球菌素質量分數0.07%。

2.4 驗證試驗

采用正交試驗優化后的最優復配天然保鮮劑配方（殼聚糖質量分數1.25%、卡拉膠質量分數0.175%、迷迭香提取物質量分數0.09%、乳酸鏈球菌素質量分數0.07%）對新鮮青蝦進行涂膜保鮮驗證試驗，4℃冷藏3 d后，涂膜試驗組青蝦的TVB-N值為（11.22±0.81）mg/100 g，均低于所有正交試驗組的TVB-N值，符合一級鮮度（≤15 mg/100 g）標準。因此，可以確定采用該復配天然保鮮劑能提升青蝦冷藏保鮮效果，所得方案切實可行。

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素4種天然保鮮劑的質量分數進行優化，確定青蝦復配天然保鮮劑的最優配方為殼聚糖質量分數1.25%、卡拉膠質量分數0.175%、迷迭香提取物質量分數0.09%、乳酸鏈球菌素質量分數0.07%，采用最優復配天然保鮮劑涂膜處理的青蝦在4℃條件下貯藏3 d后，青蝦的 TVB-N 值為（11.22±0.81）mg/100 g，符合一級鮮度（≤15 mg/100 g）標準，青蝦保鮮效果良好，說明采用殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素4種天然保鮮劑進行復配對青蝦進行涂膜保鮮處理，能抑制青蝦體內腐敗微生物生長，達到延緩青蝦腐敗變質的效果。