PpPRR5 基因在不同光合速率梨品種中的表達分析

劉 政，安 琳，伍 濤，秦仲麒，楊 立，程寅勝

（1.湖北省農業科學院果樹茶葉研究所/湖北省農業科技創新中心果樹茶葉研究分中心，武漢 430064；2.華中農業大學園藝植物生物學教育部重點實驗室，武漢 430072）

伴隨晝夜和季節周期性交替，生物體進化出“生物鐘”這種內在調節機制，使之適應可預測的日常環境變化，達到更好生長和發育的目的［1，2］。光是植物生物鐘最主要的外界環境信號，植物通過各種光受體（如光敏色素、隱花色素等）感知光強/光質變化，并將信號轉遞給中央振蕩器［3，4］。中央振蕩器是植物生物鐘的核心部分，它通過一系列連鎖的轉錄-翻譯反饋路徑產生周期性調控信號，并將其傳遞給下游調控基因［5，6］。目前已有研究表明，植物通過生物鐘機制產生與環境信號相適應的節律，最終通過輸出途徑調節光合作用，進而促進生物量積累。例如，生物鐘能控制赤桉、菜豆和棉花的氣孔導度呈現24 h 周期性節律變化，這種變化形式與晝夜光照強弱變化相適應，進而更有效地促進白天碳同化過程［7，8］。糖等光合作用產物是植物生物鐘一種重要的代謝輸出形式，而內源的糖信號又反過來調控生物鐘基因的表達［9］。玉米雜種中，正是由于生物鐘基因ZmCCA1瞬時結合活性發生改變，提高了光合作用碳固定過程相關基因表達水平，進而促進雜種表現出比雙親更高的產量［10］。

梨是中國重要的果樹物種，其冠層結構決定了光環境，進而對光合作用產生影響。為了探索梨樹不同冠層光環境對光合作用變化的影響，前期利用轉錄組和光合生理數據關聯分析的方法，發現生物鐘周期節律代謝途徑顯著富集與田間梨樹凈光合速率表型密切相關的基因模塊，并發現梨生物鐘基因PpPRR5是該模塊的核心基因，然而該基因影響梨樹光合作用的功能尚未闡明。在擬南芥中，PpPRR5同源基因AtPRR5被報道是植物特有的偽應答調節蛋白（Pseudo-Response Regulator）家族成員之一［11，12］。AtPRR5與家族其他成員協同調控了擬南芥生物鐘節律［13］。超量表達AtPRR5表現出短日照提早開花和紅光下呈現下胚軸變短的特征［14］；而Atprr5單突變體表現完全相反的表型［15］，三突變體（Atprr5 Atprr7 Atprr9）不僅表現出更為嚴重的相應缺失表型［16］，而且還呈現出抑制側根形成和更高淀粉含量（特別是在黎明時期）的特點［17］。以上研究表明，AtPRR5響應光信號轉導，并在控制開花時間和早期光形態建成方面具有重要的功能。

基于AtPRR5基因具有以上重要功能，研究者對其調控機理進行了深入探索。AtPRR家族是按照AtPRR9→AtPRR7→AtPRR5→AtPRR3→AtPRR1/AtTOC1的順序從黎明到黃昏依次轉錄翻譯到最高峰，并呈現出晝夜周期性規律，它們又共同對AtCCA1和AtLHY的表達具有反饋調節作用［13，18，19］。參與紅光信號輸入的轉錄調控者AtLNK1/AtLNK2能與AtRVE4/AtRVE8蛋白結合形成復合體，然后作用于AtPRR5啟動子驅動 其表 達；而AtPRR5 反過 來與AtLNK1、AtLNK2、AtRVE4和AtRVE8的啟動子結合，對其表達產生負反饋抑制效應［20］。AtPRR5還參與到翻譯后水平調控：AtPRR5的轉錄水平和蛋白水平并不完全同步；在光形態建成早期階段，AtZTL 蛋白能通過結合AtPRR5的PR結構域介導其泛素化降解；藍光具有活化AtZTL的LOV 結構域作用，進而通過改變與AtPRR5的結合構象影響其蛋白穩定性［21］。以上研究表明，AtPRR5表達能受到晝夜光強變化和不同光質調控，并與重要功能基因在多種調控水平上發生互作。

前期研究表明，梨PpPRR5基因在調控光合作用中可能發揮重要功能［22］。其同源基因研究表明PRR5基因響應光信號的特性，但調控光合作用的機制尚未闡明。因此，進一步明晰PpPRR5對梨樹光合作用的調控作用，對于挖掘關鍵基因加速梨樹高光效分子育種以及探索高光效栽培措施具有重要意義。本研究比較分析了不同類型梨品種（包括砂梨、白梨以及西洋梨）光合作用差異，檢測了PpPRR5基因在不同品種中的表達水平變化模式，該研究結果為進一步解析PpPRR5在梨樹光合作用中的作用提供分子水平上的證據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與光合速率測定

不同梨品種的光合作用測定試驗在湖北省農業科學院果樹茶葉研究所梨遺傳育種圃進行。供試梨品種為阿巴特（西洋梨）、伏茄（西洋梨）、碭山酥梨（白梨）、中梨1 號（白梨與砂梨的雜交種）、翠冠（砂梨）。各品種栽培管理一致，測定樹冠向陽面的外圍長勢中庸的新稍中部（5～6 葉位），葉齡為90 d。凈光合速率使用美國PP SYSTEMS 公司的CIRAS-3 便攜式光合作用測定系統在上午9：00—10：00 進行測定。每個品種隨機選擇3 片葉作為3 次生物學重復，測定后迅速放進液氮，并于-80 ℃長期保存。

1.2 總RNA 提取、質量檢測與cDNA 合成

利用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取不同梨品種葉組織的總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳評價RNA的完整性，NanoPhotometerTM-spectrophotometer（IMPLEN，Germany）檢測其濃度。以總RNA 為模板，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，USA）進行cDNA 第一鏈的合成。上述操作過程均按照試劑盒說明書進行。

1.3 qRT-PCR 分析

實時熒光定量PCR 在ABI（Applied Biosytems）7500 機器上進行，qRT-PCR 反應體系為10 μL，其中包括0.5 μL cDNA，0.5 μL正向、反向引物，5 μL的2×SYBR GREEN PCR Master Mix（Applied Biosystems，USA），ddH2O 補齊至10 μL。qRT-PCR 反應程序為：50 ℃，5 min；40 個循環（95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min）。反應結束后進行熔解曲線分析，用于檢測引物擴增的特異性。利用Primer Premier 5.0 軟件設計PpPRR5定量引物，正向引物為5′-ATCATC ACTCTGGCTACTG-3′，反向引物為5′-CCTTTCAC GGGAACTGG-3′。選擇在梨葉組織中穩定表達的SKD1和YLS8基因共同作為標準化因子［23］。基因的相對表達量分析用2-ΔΔCt法，每個樣品做3 次生物學重復和4 次技術重復。

1.4 數據分析

運用IBM SPSS Statistics 19 軟件對試驗結果進行差異顯著性檢驗，顯著水平P≤0.05。

2 結果與分析

2.1 不同梨品種凈光合速率差異

不同梨品種之間凈光合速率存在差異，凈光合速率由高到低依次為翠冠＞中梨1 號＞碭山酥梨＞伏茄＞阿巴特（圖1）。由圖1 可以發現，2 個西洋梨類（伏茄和阿巴特）品種光合能力相對較弱；砂梨類品種（翠冠）光合速率最高，且與西洋梨類和白梨類（碭山酥梨）有顯著性差異；碭山酥梨和中梨1 號（白梨與砂梨的雜交種）光合速率居中。

圖1 不同梨品種凈光合速率

2.2 PpPRR5基因在不同梨品種中的表達變化模式

利用qRT-PCR 技術檢測了PpPRR5在不同梨品種中的表達模式，發現PpPRR5表達水平在不同梨品種葉組織中存在顯著性差異，其相對表達量由高到低的順序是阿巴特＞伏茄＞碭山酥梨＞中梨1 號＞翠冠（圖2）。PpPRR5在不同品種中的表達模式與凈光合速率高低的變化趨勢相反，暗示PpPRR5可能是梨光合作用的一個負調控因子。

圖2 PpPRR5 基因在不同梨品種中的表達變化模式

3 小結與討論

前期研究篩選出一個與梨樹冠層光合作用密切相關的基因PpPRR5，發現相對于開張的冠層區域葉片（凈光合速率值較高），PpPRR5在郁閉的冠層區域葉片（凈光合速率值較低）中表達水平更高［22］。本研究進一步發現，PpPRR5表達水平與不同梨品種的光合作用能力呈負相關性（圖2）。PpPRR5表達分析結果表明，該基因可能是一個梨樹光合作用的負調控因子。其擬南芥同源基因AtPRR5被報道響應紅光信號，靶基因直接參與到紅光/遠紅光信號途徑［11］。光譜檢測分析發現，相對于高光效栽培模式，光合作用密切相關的紅光含量在傳統栽培模式的冠層內膛顯著降低，這些變化的光信號可能是光合速率差異的主要環境因素［22］。基于前期研究結果以及前人對生物鐘的研究認識，推測由于果園冠層環境和晝夜變化均存在不斷變化的光信號，生物鐘關鍵基因PpPRR5可能響應外界光信號并對梨樹光合作用水平產生調控作用。未來可在梨中對PpPRR5進行深入的功能解析，并從靶基因互作這個角度進一步探索其調控光合作用的分子機制，為梨樹高光效分子育種提供基因資源。