UPLC 法測定黃黑小斑蝥中的斑蝥素

雷欣宇，陳 松，劉昌華，仲伶俐，李 曦

（四川省農業科學院，a.農業質量標準與檢測技術研究所；b.植物保護研究所，成都 610066）

斑蝥又名芫菁、斑貓、地膽，為鞘翅目芫菁科昆蟲，蟲體具有特殊臭氣，在全國大部分地區均有分布。據藥典記載，斑蝥性味辛、熱，有大毒，歸肝、胃、腎經，具有破血逐瘀、散結消瘸、攻毒蝕瘡的功效［1］。斑蝥有效成分為斑蝥素，現代醫學對斑蝥素藥用功能研究發現，斑蝥素及其衍生物對腫瘤細胞活性具有明顯抑制作用［2］，在臨床上對肝癌、胃癌、卵巢癌等均具有一定療效。收錄于《中華人民共和國藥典》的藥用斑蝥有南方大斑蝥（Mylabris phalerataPallas）和黃黑小斑蝥（Mylabris cichoriiLinnaeus）2 種，其斑蝥素含量要求不得少于0.35%。近年有關斑蝥素含量的研究主要集中在不同種類、不同發育階段、不同部位以及不同飼養方式［3-6］，針對同種斑蝥在野生與飼養條件下的斑蝥素研究卻鮮有報道。目前斑蝥素的測定大部分采用氣相色譜和普通液相色譜法，UPLC 具有比普通液相色譜分離度好、靈敏度高、分析速度快等優點，其用于斑蝥素測定尚未見報道。本研究建立UPLC 法測定斑蝥素，可為斑蝥的質量控制提供一個科學高效的評價方法，通過對野生與人工飼養黃黑小斑蝥中斑蝥素含量進行比較，以期為飼養斑蝥的藥用開發可能性提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1290Ⅱ超高效液相色譜儀（配紫外檢測器），美國Agilent 公司；IKA-RV10 渦旋蒸發儀，德國IKA公司；AUY220型分析天平，日本島津公司；QIlinbeier渦旋混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ5200DE超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與供試樣品

乙腈（色譜純），美國Fisher 公司；丙酮（分析純），西隴化工；濃鹽酸（分析純），西隴化工；斑蝥素對照品（CAS 號：56-25-7，純度＞98%），北京索萊寶科技有限公司。黃黑小斑蝥，野生樣品與飼養樣品均由四川省農業科學院植物保護研究所提供。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件與系統適用性 色譜柱ACQUITY UPLCBEH C18（2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm）；流動相乙腈+水（40+60）；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量2 μL；紫外檢測波長230 nm。此條件下色譜見圖1，色譜峰理論板數按斑蝥素計大于3 600，斑蝥素保留時間為3.61 min，比普通液相法提早近60%［7］。斑蝥樣品色譜圖中目標峰與干擾峰之間分離度大于1.5，滿足分離要求。

圖1 斑蝥素對照品（A）與供試品（B）UPLC 色譜

1.3.2 溶液制備

1）對照品溶液制備。精密稱取斑蝥素對照品10 mg，乙腈溶解并定容至10 mL 容量瓶中，配成濃度為1 mg/mL的斑蝥素對照品儲備液。

2）供試品溶液制備。精密稱取經60 ℃烘干、粉碎后的斑蝥樣品粉末0.5 g 于錐形瓶中，加入1.0%鹽酸/丙酮30 mL，超聲處理30 min。提取液過濾，用少量丙酮分次洗滌錐形瓶，洗液并入濾液中。濾液經旋轉蒸發儀濃縮至近干，準確加入2 mL 乙腈，過0.22 μm 濾膜，即得。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 線性關系與靈敏度 精密吸取對照品溶液，準確配制成濃度為0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL 系列對照品標準溶液，由低到高依次進樣檢測。以峰面積為縱坐標（y），對應標準溶液濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線，得到回歸方程為y=464.156x-0.878 6，相關系數為0.999 9，表明斑蝥素在0.02～1.00 mg/mL 線性關系良好。將斑蝥素對照品溶液逐級稀釋進樣檢測，以信噪比（S/N）＞3 時的質量濃度為檢出限，信噪比（S/N）＞10 時的質量濃度為定量限，再根據方法的稀釋倍數換算，計算得方法檢出限為40 mg/kg，定量限為80 mg/kg。

2.1.2 精密度試驗 取低、中、高3 個濃度的斑蝥素對照品溶液，按照色譜條件連續進樣6 次，其保留時間與峰面積RSD見表1，表明儀器精密度良好。

表1 斑蝥素精密度試驗結果

2.1.3 穩定性試驗 取同一批對照品溶液放置于4 ℃冰箱和儀器自動進樣室內，分別于0、2、8、16、24 h 進樣測定，其峰面積RSD見表2，表明斑蝥素在4 ℃冰箱和儀器自動進樣室內放置24 h 均可保持穩定。

表2 斑蝥素穩定性試驗結果

2.1.4 回收率與重復性 將經過多次提取后的斑蝥樣品回收作為陰性樣，分別添加不同濃度的斑蝥素對照品溶液，每個水平做5 份，制備供試品溶液，按色譜條件測定。由表3 可知，不同添加水平的斑蝥素回收率為97.9%～100.9%，RSD為1.7%～3.8%，說明該方法準確、可靠，可應用于斑蝥中斑蝥素的測定。

表3 斑蝥素加標回收試驗結果

2.2 酸提試驗

分別以丙酮和1%鹽酸/丙酮作為提取液，測定經超聲提取后野生和人工飼養斑蝥中斑蝥素含量。結果表明（表4），酸提液能顯著提高斑蝥素得率，其中人工飼養斑蝥素得率提高了近1 倍，野生得率提高了近2 倍。

表4 提取液對斑蝥素得率的影響（單位：%）

2.3 樣品含量測定

2 種方法測得野生和人工飼養斑蝥中斑蝥素的含量結果見表5。

表5 野生與人工飼養斑蝥中斑蝥素測定結果（單位：%）

3 討論

3.1 色譜條件的優化

分別比較了甲醇/水、甲醇/甲酸水、乙腈/水和乙腈/甲酸水4 種流動相的分離效果，其中含有甲酸的流動相出峰雜亂，無法分離目標物；與甲醇/水體系相比，乙腈/水流動相分離度更好，干擾峰少且峰形尖銳對稱。隨著乙腈比例增加，目標物保留時間明顯提前，但考慮樣品基質復雜，出峰過早容易受雜質峰干擾，為保證分離效果，選擇乙腈/水以40∶60 比例進行等梯度洗脫。

3.2 提取方式的選擇

斑蝥素提取常用有索氏提取、冷浸提取、超聲提取等方法［8，9］。試驗采用操作簡便的超聲提取法，分別考察了溶劑提取量（15、30、60、90、120 mL）、提取時間（10、20、30、40、60 min）和提取溶劑（丙酮、乙醇、氯仿、乙腈、乙酸乙酯、甲醇）對斑蝥素提取效果的影響，結果表明采用30 mL 丙酮超聲提取30 min的效果最好。

3.3 酸提試驗效果

斑蝥素是一種酸酐，能與鈉、鈣、鎂、鉀等金屬元素結合，形成斑蝥素鈉鹽、鈣鹽或鎂鹽等結合性斑蝥素。斑蝥體內的斑蝥素通常以游離態和結合態形式同時存在，結合態斑蝥素在酸性條件下能夠水解出游離斑蝥素，因此經水解后檢測的斑蝥素更能反映出總體水平。在參考相關文獻基礎上［10，11］，試驗考察了鹽酸、甲酸、醋酸對斑蝥素提取效果的影響，結果以1%鹽酸提取效果最佳。酸提試驗結果表明，野生斑蝥和人工飼養斑蝥經1%鹽酸/丙酮提取后測得斑蝥素含量相比丙酮提取法有1～2 倍的提升，提取效果顯著。表明野生斑蝥與飼養斑蝥均存在結合態斑蝥素，經酸水解成游離態后被一同檢測出來，因此測得值為斑蝥素總量值。同時，從加酸與不加酸處理的結果差值大小來看，野生斑蝥中斑蝥素以結合形態為主，人工飼養斑蝥中斑蝥素游離態和結合態占比基本持平。

3.4 樣品含量分析

本研究方法測得野生和人工飼養斑蝥中斑蝥素含量分別為3.080%和1.630%，約為藥典法測得值的3～4 倍。藥典法采用二氯甲烷提取，測定結果僅反映斑蝥體內游離斑蝥素含量，本研究方法檢測出的斑蝥素總量更能準確反映出斑蝥素真實水平，這對于斑蝥的用藥安全具有一定的參考價值。野生斑蝥游離和總量斑蝥素均高于人工飼養斑蝥，顯現出了品種優勢，但人工飼養斑蝥的斑蝥素含量符合藥典對斑蝥藥材來源中斑蝥素含量的規定，表明人工飼養斑蝥亦可作為提取斑蝥素的來源藥材，這對于緩解因野生斑蝥資源緊缺造成的市場供求矛盾有積極作用。目前斑蝥人工飼養的研究已有相關報道［12，13］，可知飼養的光溫土壤環境、喂養食物種類等均會對斑蝥素的累積產生影響。如何優化斑蝥養殖技術，獲取高質量斑蝥素尚待繼續研究。