景天三七根、莖、花、葉中總黃酮含量測定

王立業，牛江秀，王真真，吳玉琦，馬紫玉，王艷艷，于志斌

（1.洛陽師范學院食品與藥品學院，河南 洛陽 471934；2.中國醫藥保健品進出口商會，北京 100010）

景天三七（Sedum aizoonL.）為景天科景天屬多年生草本植物，又名菊葉三七、養心草、八仙草、活血丹、血山草、長生景天、金不換等，素有高原人參和雪山仙草之稱，是中國傳統的藥食兩用植物，全年可采集，全草或根均可入藥或食用。由于其易于栽培種植，生命力頑強，近年來被大量種植，廣泛分布于中國東北、西北、華北及長江流域各省市［1］。景天三七性平，味甘、微酸，歸心、肝經，具有涼血止血、消炎、散瘀止痛、解毒消腫、滋陰養血、安神的功效，常用于治療跌打損傷、創傷出血、吐血、產后血氣痛等?，F代藥理研究表明，景天三七具有抗衰老、抗缺氧、抗疲勞、抗炎及改善心腦血管系統及免疫調節作用［2］。

近年來對景天三七的研究越來越受到重視，研究表明，景天三七所含有效成分有多糖類、黃酮類、酚酸類、生物堿類、β-谷甾醇等［3］。其中，黃酮類是景天三七的主要功效成分之一。黃酮類是具有C6-C3-C6基本骨架（圖1）化合物的總稱，是廣泛存在于植物界的一大類天然產物，如楊梅黃酮、山楂黃酮、大豆異黃酮等，種類繁多，常作為藥材質量控制指標［4］。黃酮類化合物具有明確而廣泛的藥理作用，具有抗氧化、抗胃潰瘍、神經保護、抗心肌缺血、降血壓、改善學習記憶認知、保護生殖系統、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤以及降血糖等多種藥理活性［5，6］。因此，對景天三七黃酮的開發具有重要的應用價值。目前對景天三七的研究多集中于提取工藝、部分功效成分的含量測定和藥理活性研究［2］，尚未建立對景天三七不同部位中總黃酮含量的測定方法，制約著景天三七黃酮的開發和利用。

圖1 黃酮類化合物的基本骨架結構

關于黃酮類物質檢測的現行標準方法主要分3類：高效液相法、液相色譜-串聯質譜法和分光光度法［7］。高效液相法和液相色譜-串聯質譜法通常需要貴重的儀器設備、操作復雜，并需要多種對照物，不能對樣品中所含有的總黃酮物質進行準確定量，缺乏適用性且應用范圍有限。分光光度法結果準確，經濟、簡單快速，并能對總黃酮含量進行準確分析，被廣泛應用于多種植物中總黃酮的含量測定。本研究擬采用索氏提取法對河南產景天三七根、莖、花、葉中的總黃酮進行提取，以NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 作顯色劑，建立景天三七根、莖、花、葉中總黃酮含量測定的分光光度方法，并對該方法的最大吸收波長、檢測限、定量限、線性、準確度、精密度進行考核，為景天三七總黃酮的含量測定提供方法學依據，同時為了解景天三七根、莖、花、葉中總黃酮的分布及有針對性的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

新鮮景天三七樣品采自河南省洛陽市、三門峽市等地區，采集時間為2019 年7—9 月，經鑒定為景天三七。將其不同部位進行分類，干燥后粉碎，過80 目篩備用。

1.2 儀器

T6 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；TU-1810 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；FA2004 電子分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 試劑與溶液

蘆丁對照品，中國食品藥品檢定研究院提供（100080-201907，含量測定用）。10 g/L 氫氧化鈉溶液：稱取10.0 g 氫氧化鈉，用水溶解后定容至1 L。50 g/L 亞硝酸鈉溶液：稱取5.0 g 亞硝酸鈉，用水溶解后定容至100 mL。100 g/L 硝酸鋁溶液：稱取10.0 g硝酸鋁，用水溶解后定容至100 mL。甲醇等其他試劑均為分析純，水為去離子水。

1.4 對照品及供試品溶液的制備

1）對照品溶液的制備。精密稱取在60 ℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品50 mg，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱使其完全溶解，冷卻至室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻。從中精密量取10 mL，轉移至100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得蘆丁對照品溶液（蘆丁含量為0.2 mg/mL）。

2）供試品溶液的制備。分別精密稱取景天三七根、莖、花、葉樣品1.0 g 于濾紙包中，置索氏提取器抽提瓶內，加甲醇90 mL，加熱回流至提取液無色，將提取液轉移至100 mL 容量瓶中，用少量甲醇洗滌容器，洗液一同并入同一容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。從中精密量取3 mL 用于測定。

1.5 測定

精密量取一定量的對照品溶液和供試品溶液，置于25 mL 容量瓶中，加水至10.0 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻后放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻后放置6 min，最后加入氫氧化鈉溶液4 mL，加水定容至刻度，搖勻后放置15 min。以相應的試劑為空白，用紫外分光光度法測定。

2 結果與分析

2.1 測定波長的選擇

精密量取供試品溶液3 mL 置于25 mL 容量瓶中，制備樣品溶液，以相應試劑為空白，于紫外分光光度計上，在190～800 nm 內進行掃描，結果見圖2。由圖2 可以看出，樣品顯色液在365 nm 處有最大吸收，因此選擇365 nm 作為景天三七總黃酮測定的最佳吸收波長。

圖2 樣品顯色液在190～800 nm的紫外掃描

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察 精密量取蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL 容量瓶中，制備樣品溶液，以相應試劑為空白，在365 nm 波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線（圖3），最小二乘法直線回歸，得蘆丁回歸方程為：y=0.017 5x+0.04，R2=0.999 9（n=5）。結果表明，蘆丁濃度在8～40 μg/mL 線性關系良好。

圖3 蘆丁標準曲線

2.2.2 檢測限與定量限 取干凈的25 mL 容量瓶20個，分別準確加入10 mL 去離子水，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻后放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻后放置6 min，最后加入氫氧化鈉溶液10 mL，加水定容至刻度，搖勻后放置15 min。以去離子水為空白，按紫外分光光度法在365 nm 處測定吸光度。檢測限和定量限分別按如下公式進行計算。

式中，σ 為空白響應的標準差；S為標準曲線斜率。

結果表明，20次空白測定的標準偏差為0.006 0，標準曲線的斜率為0.017 5，由此可計算得到方法的檢測限為1.13 μg/mL，定量限為3.43 μg/mL。

2.2.3 精密度試驗 分別準確稱取景天三七根、莖、花、葉粉末樣品1.0 g，制備樣品溶液。精密量取3.0 mL 測定吸光度，重復測定6 次，結果見表1。由表1可知，根、莖、花、葉中總黃酮含量的平均值分別為2.94%、2.80%、0.98%和1.62%，RSD分別為0.14%、0.09%、0.04%和0.05%，變異系數均≤2%，表明該方法的精密度良好。

表1 景天三七根莖花葉中總黃酮含量測定精密度考察結果

2.2.4 準確度試驗 方法的準確度以樣品添加回收試驗進行評價。精密吸取蘆丁對照品溶液（濃度為0.2 mg/mL）0.5、1.0、2.0 mL 各3 份，置于25 mL 容量瓶中，分別加入已知含量的景天三七根、莖、花、葉供試品溶液樣品溶液3.0 mL，測定吸光度?；厥章视嬎愎饺缦?。

式中，P為蘆丁添加回收率，%；A為樣品添加后的吸光度；A0為樣品添加前的吸光度；m為蘆丁的加入量，mg。

景天三七根、莖、花、葉中不同添加水平的回收率結果見表2。由表2 可知，景天三七根、莖、花、葉中低、中、高3 個添加濃度蘆丁的平均回收率分別為93.87%、92.85%、94.58%和93.00%，RSD分別為4.31%、3.42%、2.39%和2.69%，RSD均≤5%，表明該方法的準確度良好，滿足定量方法學的要求。

表2 景天三七根、莖、花、葉總黃酮含量測定準確度考察結果

2.2.5 穩定性試驗 將制備的根、莖、花、葉供試品顯色后，分別在0、30、60、90、120、180 min 測定其吸光度，考察供試品顯色后的穩定性，結果見圖4。由圖4 可知，隨著放置時間的延長，樣品的吸光度逐漸增大，在顯色后第90 min，吸光度變化值小于5%，表明所有樣品顯色后在90 min 內穩定，測定應在顯色后90 min 內完成。

圖4 景天三七根、莖、花、葉樣品顯色后穩定性試驗結果

2.3 景天三七根、莖、花、葉中總黃酮含量測定結果

按照所建立的方法，對景天三七根、莖、花、葉中總黃酮的含量進行測定，根據蘆丁標準曲線的回歸方程，計算得出河南產景天三七根、莖、花、葉中總黃酮的含量見表3。由表3 可知，所采集河南產景天三七根、莖、花、葉中總黃酮的平均含量分別為（29.44±1.37）、（27.96±0.87）、（9.79±0.36）、（16.16±0.50）mg/g（以蘆丁量/干材料表示，n=6）。

表3 景天三七根、莖、花、葉中總黃酮的測定結果（n=6）

3 討論

黃酮類化合物因具有多種生物活性、藥理作用和復雜的藥效作用機制，一直是藥物研發領域關注的重點。根據C6-C3-C6基本骨架上中央三碳的氧化程度、是否成環、B 環的聯接位點等特點，可將該類化合物分為多種結構類型，如黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮；異黃烷酮、查耳酮、二氫查耳酮、橙酮、黃烷和黃烷醇、花色素類、雙黃酮類［8］。盡管黃酮類單體多種多樣，但黃酮類化合物中常帶有可與鋁鹽、鉛鹽、鋯鹽、鎂鹽、鍶鹽、鐵鹽等試劑發生反應的結構單元，生成有色絡合物。因此金屬鹽類試劑絡合顯色-分光光度法被作為測定總黃酮含量的常用方法［7］。因顯色劑NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色穩定、價格低廉、環境污染小等因素，被廣泛應用于中草藥中總黃酮的含量測定，檢測波長為510 nm［9］。考慮到不同植物中黃酮的種類差異，本研究對景天三七黃酮經NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色后的最大吸收波長進行了測定，在波長190～800 nm的紫外分光光度掃描結果表明，景天三七黃酮與鋁鹽在365 nm 有最大吸收，而在510 nm 附近的吸收峰不明顯，為使分析具有更好的靈敏度和特異性，因此選擇365 nm 作為測定波長，在該波長下，對照品蘆丁濃度在8～40 μg/mL，標準曲線的線性相關系數R2=0.999 9，表明在選擇的測定波長下，標準曲線的線性關系良好，滿足定量方法學的要求。

黃酮類化合物是一類廣泛存在于蔬菜、水果和中草藥中的化合物，是植物的次級代謝產物。由于結構中多含有苷元，一般難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機溶劑和稀堿液。根據文獻報道［10］，黃酮的提取方法有溶液提取法、超聲提取法、復合酶輔助高壓提取法、減壓內部沸騰法和超聲輔助雙水相萃取法等。溶液提取法中，甲醇和乙醇普遍應用于苷和苷元，熱水提取法普遍應用于黃酮苷?？紤]到甲醇和乙醇性質的相似性，本研究比較了甲醇和熱水作為溶劑對景天三七總黃酮的提取效率，結果顯示，甲醇作提取劑時黃酮的測得量顯著高于熱水，表明景天三七所含黃酮以含苷或苷元為主的黃酮類物質。由于索氏提取法具有操作簡單、試劑可以反復循環、提取效率高，同時能避免其他方法多次提取造成的操作誤差等優勢，本研究建立以甲醇為溶劑，索氏提取法對景天三七黃酮測定的樣品前處理方法，方法學考察顯示，根、莖、花、葉中低、中、高3 個水平蘆丁的平均回收率均≥92%，變異系數≤5%，表明所建立的樣品前處理方法對景天三七黃酮具有較好的提取效率和穩定性。

按照所建立的方法，對河南產景天三七根、莖、花、葉中總黃酮的測定結果表明，景天三七根、莖、花、葉普遍存在黃酮類化合物，但各個部位樣品中總黃酮含量存在差異?？傸S酮含量最高的為根，含量可達29.44 mg/g，其次是莖，其總黃酮含量為27.96 mg/g，葉中總黃酮含量為16.16 mg/g；花中總黃酮含量最少，僅為9.79 mg/g。這與紫萁（根狀莖＞葉）［11］、青錢柳（根＞莖＞葉）［12］、藜蒿（根＞莖＞嫩芽）［13］等植株中的總黃酮分布趨于一致，但與沙棘（根＜莖＜葉）［14］、蕎麥（莖＜根＜果＜葉＜花）［15］等植株中的總黃酮分布呈相反趨勢，表明黃酮類化合物在不同植物器官中的分布與植物器官所承擔的功能有關，同時也呈現一定的種屬差異。因此，對不同植株中黃酮類物質的開發利用應具體問題具體分析。就景天三七而言，莖葉部分通常作蔬菜等食用，根食用的普遍性受到限制，但根部黃酮含量最高，如果能將其作為原料進行化工或功能食品開發，將進一步提高景天三七應用的市場價值。對比其他地區景天三七黃酮的含量，本研究所測定的河南產景天三七黃酮含量 低于 陜西 產（39.57±0.59）mg/g［16］，高 于河 北產（18.39.57±0.40）mg/g，與黔產28.32 mg/g 相當［17］，除了可能的采收時期影響外，表明不同產地的景天三七中黃酮含量存在一定的差異。