一株產吲哚乙酸巴基斯坦賴氨酸芽胞桿菌的快速篩選與鑒定

閔 勇，劉曉艷，陳 凌，朱 鐳，邱一敏，周榮華

（湖北省生物農藥工程研究中心，武漢 430064）

自1978 美國奧本大學的J.W.Kloepper 首次提出植物根際促生細菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）的概念以來，PGPR 研究始終是農業微生物學和植物病理學領域的熱點。PGPR 可以通過多種機制來促進作物的生長，具體的作用機制主要有以下幾個方面：一、直接分泌植物生長激素來促進植物生長；二、分泌有機酸和水解酶類增加植物對營養成分的吸收；三、抑制植物的病害；四、誘導作物系統抗性［1］。在大多數研究中，一種PGPR 通常是通過多種方式協同作用來促進植物的生長。

芽胞桿菌由于其產生芽胞，能夠在不同的生境中生存，是研究廣泛、深入的PGPR 類群。枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）普遍存在于多種植物的根際土壤中，通過產生伊枯草菌素A（Iturin A）、豐原素（Fengycin）和表面活性素（Surfactin）等脂肽類抗生素來抑制土傳真菌性病害，同時還能產生IAA，具有生物固氮能力［2］；某些多粘類芽胞桿菌（Paenibacillus polymyxa）具有生物固氮能力，還產生吲哚乙酸（IAA）、細胞分裂素等植物激素；同時，多粘類芽胞桿菌還產生殺鐮孢菌素（Fusaricidin）、多粘菌素（Polymyxin）等抗生素類物質來抑制植物細菌和真菌性病害［3］。部分巨大芽胞桿菌（Bacillus megateri-um）具有溶磷、解磷能力，能促進作物對磷元素的吸收；部分地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis）具有解鉀的能力，促進作物對鉀元素的吸收利用。PGPR類芽胞桿菌通過協同作用共同促進植物的生長。

長期以來，化肥農藥的使用對中國現代農業生產起到了至關重要的作用，但長期不合理的使用對生態環境、糧食安全和人類健康都構成了嚴重威脅，迫切需要轉變生產方式，利用環境友好的生物有機肥產品來部分替代化肥，使用生物農藥部分替代化學農藥。吲哚乙酸（IAA）作為一種重要的植物激素，能夠促進植物的生長，利用IAA 產生菌生產生物有機肥具有重要的生產意義［4］。

本研究對實驗室保藏的芽胞桿菌進行產IAA 能力篩選，以期篩選獲得產IAA 能力較強的芽胞桿菌菌株，為下一步制備功能生物有機肥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌株：湖北省生物農藥工程研究中心從土壤中分離并保藏的1 920 株芽孢桿菌。

化學試劑：色氨酸（L-tryptohane，純度＞99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產），吲哚乙酸標準品（Indole-3-aceticacid，純度＞99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產）。

Salkowski 顯色劑：配置濃度為0.5 mol/L FeCl3溶液，取1 mL FeCl3溶液到50 mL 35% HClO4中搖勻，現配現用，操作時避光。

種子LB 培養基：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 5 g，溶于1 000 mL去離子水中（pH=7.0）；篩選培養基：LB培養基中加入終濃度為3 mmol/L的色氨酸。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌活化 在96孔板中每孔各加入0.5 mL LB 培養基，滅菌后接種芽孢桿菌菌株，將96 孔板放置在粘板上于30 ℃，250 r/min條件下振蕩培養48 h。

1.2.2 產IAA 芽孢桿菌的初篩 在滅菌的96 孔板中每孔加入0.5 mL 初篩培養基，吸取10 μL 活化好的芽孢桿菌菌液轉移其中，于30 ℃、250 r/min 條件下振蕩培養48 h。吸取200 μL 菌懸液于96 孔無菌細胞培養板孔中，于4 ℃、4 000 r/min 離心10 min，吸取100 μL 上清液于96 孔細胞培養板中，加入等體積Salkowski 顯色劑。以初篩培養基作為陰性對照，以20 mg/L IAA 標準液作為陽性對照。將96 孔板置于室溫、避光環境下反應30 min，細胞培養板上孔的顏色變紅則表示該菌株具有產生IAA的能力。

1.2.3 產IAA 菌株的定量復篩 將初篩中顏色反應明顯的菌株進一步定量IAA的產量。標準曲線采用IAA 標準品制作，配置的IAA 標準曲線濃度依次為10，20，30，40，50，60，80，100 mg/L，分別吸取IAA 標準溶液100 μL，等體積加入Salkowski 顯色劑，置于室溫、避光環境下反應30 min，取出后立即用酶標儀測定A535nm，以加入了顯色劑的培養基調零，重復3次，獲得數據制作標準曲線。取1 mL 芽孢桿菌的菌懸液以4 000 r/min 離心10 min，取上清100 μL，等體積加入Salkowski 顯色劑，置于室溫、避光環境下反應30 min，測定其A535nm，根據標準曲線，計算單位體積發酵液中IAA的含量。

1.2.4 菌株的鑒定

1）形態觀察。菌株接種于LB 固體培養基平板上，30 ℃培養48 h，觀察菌落形態、色澤，顯微鏡觀察細胞形狀等。

2）細菌16S rDNA 序列測定。提取細菌基因組DNA；16S rDNA 基因序列的PCR 擴增，引物為27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R 5′AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′；PCR 產物送測序；測序結果在EzBioCloud 網站上進行比對，從網站數據庫中獲取與菌株16S rDNA 同源的基因序列數據，利用MEGAX 軟件做系統發育分析。

2 結果與分析

2.1 產IAA 芽孢桿菌的初篩

通過96 孔板微培養，對保藏的1 920 株芽孢桿菌進行了活化，通過Salkowski 比色法對1 920 株芽孢桿菌進行了初篩，再通過測量吸光度初步選取12株具有明顯產IAA 能力的芽胞桿菌菌株進入后續的定量復篩。

表1 產IAA 芽孢桿菌初篩結果

2.2 IAA 標準曲線的制作

將系列IAA 標準溶液（10，20，30，40，50，60，80，100 mg/L）與Salkowski 顯色劑反應，測得不同IAA 濃度下對應的吸光度A535，如表2。

表2 不同IAA 濃度下樣品的吸光度

以IAA 標準溶液濃度為橫坐標，縱坐標為對應濃度在535 nm的吸光值，繪制散點圖并添加線性趨勢線，得到IAA 標準曲線見圖1。由圖1 可知，線性回歸方程y=0.020 1x+0.117 7，R2=0.995 9，擬合優度較好。故可根據此方程計算發酵液中IAA的含量。

圖1 IAA 標準曲線

2.3 產IAA 芽孢桿菌的定量復篩

根據標準曲線，對初篩的12 株芽孢桿菌進行了產IAA 能力的復篩，結果見表3。由表3 可知，2750號菌株的產IAA 能力達到（118.23±5.55）mg/L，明顯優于其他11 株芽胞桿菌。

表3 產IAA 芽孢桿菌復篩結果

2.4 菌株分子鑒定

將2750 號芽胞桿菌菌株的16S rDNA 基因測序結果在EzBioCloud 網站上進行序列比對，從網站數據庫中選取與菌株16S rDNA 同源的基因序列數據，然后用MEGAX 軟件進行系統發育分析。結果如圖2 所示。由圖2 可知，2750 號芽胞桿菌與巴基斯坦賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus pakistanensis）位于同一分支，同源性100%。

圖2 2750 號芽胞桿菌系統進化樹

3 小結與討論

隨著人們生活水平的提高，對農產品質量和生態環境保護的關注度也在持續提高，化肥已不能滿足現代農業發展的需要。為實現農業的健康可持續發展，開發新型高效環保肥料勢在必行。同時，農業污染已經超過了工業和城市生活污染，成為中國最大的面源污染源。積極探索農業廢棄物資源化利用的方式，已成為了中國農業研究的熱點。在此背景下，生物有機肥以其獨特的優勢為農業廢棄物和作物生長搭建起一座橋梁，開辟出一條“農業廢棄物—生物有機肥—作物”循環模式的可持續發展道路［5］。與化肥相比，生物有機肥具有提高作物產量、改善作物品質、增強作物抗逆性、提高化肥利用率和改善土壤微生態環境的作用。生物有機肥要發揮的這些功能，就要添加具有特定功能的微生物菌種。PGPR類芽胞桿菌具有促進作物生長的功效，是生物有機肥產品開發中重點關注的一類功能菌株。

由于IAA的類似物與Salkowski 顯色劑也能產生顏色反應，采用高效液相色譜法測量實際的IAA的產量應該比比色法要低。在產品開發過程中將采用更為準確的高效液相色譜法對該菌株進行深入評價。

本研究未對巴基斯坦賴氨酸芽孢桿菌產IAA 能力進行培養基優化，培養基優化后的菌株產IAA 能力尚未知。在后續的研究中將通過培養基優化進一步提高該菌株的產IAA 能力，同時進行盆栽和田間試驗評價其作用。