仙靈骨葆膠囊對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨生長(zhǎng)因子及骨折愈合的影響

黃振峰 王建 陳夢(mèng)妮 肖軍

1. 武漢市第四人民醫(yī)院古田院區(qū)創(chuàng)傷骨科，湖北 武漢 430000 2. 淄博市臨淄區(qū)齊都醫(yī)院關(guān)節(jié)與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，山東 淄博 255400 3. 武漢市同濟(jì)醫(yī)院手術(shù)室，湖北 武漢 430000

隨著中國(guó)乃至全世界人口結(jié)構(gòu)日趨老齡化，骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)已成為中老年常見(jiàn)病和多發(fā)疾病，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)作為OP最嚴(yán)重的并發(fā)癥，OPF因骨質(zhì)疏松個(gè)體骨質(zhì)量下降，骨骼組織學(xué)基礎(chǔ)變差，骨折愈合過(guò)程緩慢，導(dǎo)致骨折愈合延遲和不愈合概率顯著增加，同時(shí)骨折后患者活動(dòng)減少，合并嚴(yán)重并發(fā)癥概率顯著增多，嚴(yán)重威脅著中老年人群的身心健康，同時(shí)也帶來(lái)了沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)[1-2]。因此，探索行之有效加速OPF的藥物研究有著非同尋常的意義。中藥治療骨質(zhì)疏松及骨折歷史悠久，療效確切，研究表明仙靈骨葆可促進(jìn)骨質(zhì)疏松性大鼠骨折早期骨痂形成，促進(jìn)去卵巢大鼠骨折愈合，已用于臨床OPF的預(yù)防和治療[3]。本研究以去勢(shì)后骨質(zhì)疏松性骨折大鼠為模型，探討仙靈骨葆膠囊對(duì)骨折愈合過(guò)程骨生長(zhǎng)因子BMP-2、IGF-1表達(dá)的影響及骨折愈合作用，以期為臨床提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

48只健康雌性4月齡Sprague-Dawley大鼠，平均體重(330±22)g，所有大鼠均由華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號(hào)：SCXK(鄂)2016-0009]，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。復(fù)方戊酸雌二醇片(國(guó)藥準(zhǔn)字：H20020299，生產(chǎn)批號(hào)：150716，浙江仙琚制藥股份有限公司)，仙靈骨葆膠囊[國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20025337，生產(chǎn)批號(hào)：141226，國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司]。血清Ⅰ型原膠原N端前肽(PINP)、骨鈣素(BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程公司，兔抗鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)和胰島素生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)多克隆抗體均購(gòu)于武漢博士德生物有限公司。計(jì)算機(jī)X射線攝像儀購(gòu)于日本Konica Minolta公司，XR-36型雙能X線骨密度儀(DXA)購(gòu)于美國(guó)Norland公司，AGS-X型萬(wàn)能精密材料試驗(yàn)機(jī)購(gòu)于日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1模型制備及分組：模型構(gòu)建參照文獻(xiàn)[4]構(gòu)建“骨質(zhì)疏松性骨折SD大鼠模型”，首先行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，腹背中線L2縱行切口，分離進(jìn)入腹腔，嚴(yán)密結(jié)扎輸卵管，切除卵巢組織，術(shù)后1周再行右側(cè)股骨干骨折髓內(nèi)固定術(shù)，右大腿外側(cè)縱行切口，分離暴露并鋸斷股骨中段，克氏針插入骨折遠(yuǎn)端，達(dá)到解剖復(fù)位，逐層間斷縫合，術(shù)后常規(guī)預(yù)防感染。術(shù)后排除造模失敗及因手術(shù)感染先后死亡大鼠。按隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、模型組、雌二醇組和仙靈骨葆組，模型組、雌二醇組和仙靈骨葆組均構(gòu)建去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折模型，假手術(shù)組開(kāi)腹后僅切除卵巢周圍部分脂肪組織，未切除雙側(cè)卵巢。于術(shù)后1周給予不同藥物干預(yù)。假手術(shù)組和模型組：0.9 % NaCl 5 mL/kg，灌胃，1次/d；雌二醇組：復(fù)方戊酸雌二醇片，0.5 mg/kg，灌胃，1次/d；仙靈骨葆組：仙靈骨葆膠囊，250 mg/kg，灌胃，1次/d，給藥8周。

1.2.2標(biāo)本收集與處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后先行計(jì)算機(jī)X射線攝像儀攝片，10 %水合氯醛麻醉，采取脫頸法處死各組大鼠，下腔靜脈采血，離心分離血清-20 ℃保存?zhèn)溆茫饘觿冸x完整取出股骨及股骨骨痂，截取骨折端股骨痂，中性甲醛固定，EDTA硝酸脫鈣，脫水透明，石蠟包埋，制備石蠟切片。

1.2.3放射性(X線)檢查：將完整的右股骨骨折標(biāo)本行計(jì)算機(jī)X射線攝像儀攝片，CR攝片條件：距離90 cm，電流3.2 mA，電壓40 kV，觀察骨折骨痂連續(xù)性及骨折愈合情況，應(yīng)用Warden[5]X線評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估，取均值。

1.2.4股骨痂骨密度(BMD)檢測(cè)：將完整的右股骨骨痂采用雙能X線骨密度掃描儀掃測(cè)，運(yùn)用小物體掃描模式：掃描寬度5.0 cm，掃描速度60 mm/s，分辨率1.0 mm×1.0 mm，準(zhǔn)確度0.01 %，分別測(cè)量各組骨痂BMD(g/cm2)，取均值。

1.2.5股骨骨生物力學(xué)檢測(cè)：骨生物力學(xué)檢測(cè)參考文獻(xiàn)[6]分別對(duì)每個(gè)股骨試樣預(yù)調(diào)處理之后進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)和壓縮實(shí)驗(yàn)，依據(jù)儀器記錄的載荷-位移曲線計(jì)算出最大荷載、最大應(yīng)力和最大位移等數(shù)據(jù)。

1.2.6骨代謝相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：采用比色法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)各組血清骨鈣素(BGP)、I型前膠原羧基前肽(PICP)濃度。

1.2.7免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)：免疫組織化學(xué)染色法參考文獻(xiàn)[7]，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞平均光密度值(MOD)進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 骨折愈合及評(píng)分骨折愈合觀察及評(píng)分

假手術(shù)組大量連續(xù)性骨痂生長(zhǎng)包饒骨折端，斷端髓腔再通，骨折線消失。模型組骨折端未見(jiàn)骨痂生長(zhǎng)，骨折線依然清晰可見(jiàn)。雌二醇組少量不連接性骨痂生長(zhǎng)包饒骨折端，骨折線部分模糊不清。仙靈骨葆組大量連續(xù)性骨痂包繞貫穿骨折端，髓腔再通，骨折線模糊不清。X射線攝片結(jié)果顯示：模型組(2.542±0.153)較假手術(shù)組(4.773±0.226)評(píng)分顯著降低(P<0.05)，雌二醇組(3.970±0.202)和仙靈骨葆組(4.520±0.235)較模型組(2.542±0.153)評(píng)分均顯著升高(P<0.05)，以仙靈骨葆組最高。見(jiàn)圖1。

圖1 X線觀察骨折愈合情況注：A： 假手術(shù)組；B： 模型組；C： 雌二醇組；D： 仙靈骨葆組。Fig.1 X-ray observation of fracture healing

2.2 各組大鼠骨痂BMD

模型組較假手術(shù)組股骨上下端骨痂BMD顯著降低(P<0.05)，雌二醇組、仙靈骨葆組均較模型組股骨上下端骨痂BMD均顯著增高(P<0.05)，以仙靈骨葆組最高。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠股骨Table 1 BMD of rat femur in each

2.3 各組大鼠骨痂生物力學(xué)

模型組較假手術(shù)組骨痂最大位移、最大應(yīng)力和最大載荷均顯著降低(P<0.05)，雌二醇組、仙靈骨葆組均較模型組骨痂最大載荷、最大應(yīng)力和最大位移均顯著升高，以仙靈骨葆組最高。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)

2.4 各組大鼠血清骨代謝相關(guān)指標(biāo)

模型組較假手術(shù)組血清BGP、PICP、TRACP-5b水平均顯著升高(P<0.05)，雌二醇組、仙靈骨葆組均較模型組血清BGP、PICP、TRACP-5b水平均顯著降低，以仙靈骨葆組最低。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)

2.5 各組大鼠骨痂BMP-2、IGF-I表達(dá)

BMP-2主要表達(dá)于成骨細(xì)胞胞漿及骨小梁的邊緣，IGF-I主要表達(dá)于成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞胞漿，棕黃色為陽(yáng)性反應(yīng)。模型組較假手術(shù)組BMP-2和IGF-I陽(yáng)性表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，雌二醇組、仙靈骨葆組較模型組BMP-2和IGF-I陽(yáng)性表達(dá)均顯著增高(P<0.05)，以仙靈骨葆組最高。見(jiàn)表4、圖2和圖3。

圖2 免疫組化觀察骨痂組織BMP-2表達(dá)(200×)注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：雌二醇組；D：仙靈骨葆組。Fig.2 The BMP-2 expression in callus was observed by Immunohistochemistry (200×)

圖3 免疫組化觀察骨痂組織IGF-I表達(dá)(200×)注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：雌二醇組；D：仙靈骨葆組。Fig.3 The IGF-I expression in callus was observed by Immunohistochemistry(200×)

表4 各組骨痂組織BMP-2、IGF-1表達(dá)

3 討論

中醫(yī)學(xué)將OP歸屬“骨痿”“骨枯”“骨瘓”“骨痹”等范疇，傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為OP發(fā)病與腎關(guān)系密切[7]。中醫(yī)理論認(rèn)為腎主身之骨髓，腎藏精，精生髓，髓生骨，骨枯髓減，發(fā)為骨痿，精足則髓足，髓足者則骨強(qiáng)，腎精充足，骨髓有源，骨骼強(qiáng)健有力，腎精虧虛，骨髓無(wú)源，骨骼痿弱無(wú)力，骨脆致病[8-9]。骨的生長(zhǎng)、發(fā)育、強(qiáng)壯、衰弱是腎中精氣盛衰的重要標(biāo)志，中藥防治OP緊緊圍繞中醫(yī)腎主骨生髓理論。

仙靈骨葆膠囊是由國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)認(rèn)證的非處方(OTC)傳統(tǒng)純中藥制劑，原方主要由淫羊藿、續(xù)斷、補(bǔ)骨脂、知母、丹參、地黃等多味中藥組成，被用于防治骨質(zhì)疏松、骨折、無(wú)菌性骨壞死[10-11]。仙靈骨葆膠囊以貴州特產(chǎn)黔嶺藿為主藥，配以續(xù)斷、補(bǔ)骨脂、知母、丹參等具有補(bǔ)腎壯骨作用的中藥合劑[12]。淫羊藿為主藥，補(bǔ)腎壯陽(yáng)堅(jiān)筋骨、祛風(fēng)除濕、強(qiáng)筋健骨之要藥，配以續(xù)斷，補(bǔ)骨脂，知母，丹參，地黃等為佐使藥，全方共奏滋補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)和強(qiáng)筋壯骨之功效[13]。研究表明仙靈骨葆膠囊通過(guò)雌激素樣作用，增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性、改善微環(huán)境和調(diào)節(jié)鈣磷微量元素代謝、增加礦物質(zhì)沉積并抑制骨吸收，提高骨量、增加骨密度和骨強(qiáng)度，增加骨折局部血流量，加速骨性骨痂形成，促進(jìn)骨質(zhì)修復(fù)和加快骨重建[14-15]。

骨折愈合過(guò)程受局部骨生長(zhǎng)因子的調(diào)控，骨細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)于成骨的誘導(dǎo)、骨基質(zhì)的合成、軟骨骨化及局部微循環(huán)的重建等過(guò)程發(fā)揮重要作用，調(diào)控著骨折再生修復(fù)過(guò)程[16-17]。BMP-2和IGF-I在骨質(zhì)疏松性骨折的愈合不同階段均起到重要的調(diào)節(jié)作用，BMP-2和IGF-I能夠刺激和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化增殖，增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性而增加骨量，加速骨重建以促進(jìn)骨折愈合[18-19]。本研究結(jié)果表明仙靈骨葆組較模型組骨折愈合評(píng)分、股骨痂BMD、股骨骨生物力學(xué)指標(biāo)、骨痂BMP-2和IGF-I陽(yáng)性表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，仙靈骨葆組較模型組血清骨代謝指標(biāo)均顯著降低(P<0.05)。說(shuō)明仙靈骨葆膠囊通過(guò)介導(dǎo)骨質(zhì)疏松骨折大鼠骨生長(zhǎng)因子BMP-2和IGF-1表達(dá)，改善骨代謝，促進(jìn)骨痂形成，增加骨密度，提高骨生物力學(xué)，促進(jìn)骨折愈合。提示仙靈骨葆膠囊可促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合過(guò)程，可能與骨折周圍骨生長(zhǎng)因子BMP-2和IGF-I的表達(dá)相關(guān)。田發(fā)明等[20]發(fā)現(xiàn)仙靈骨葆膠囊可提高骨質(zhì)疏松骨折大鼠骨痂組織的血管數(shù)量，上調(diào)BMP-2表達(dá)，促進(jìn)骨折愈合血管形成。穆樹(shù)林等[21]研究發(fā)現(xiàn)仙靈骨葆膠囊可能通過(guò)上調(diào)骨質(zhì)疏松骨折大鼠BMP-2表達(dá)，加快編織骨向板層骨的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)骨折愈合。吳繼云等[22]研究發(fā)現(xiàn)仙靈骨葆膠囊可促進(jìn)老齡去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合過(guò)程，可能機(jī)制與提高骨折周圍軟組織PDGF、TGF-β和VEGF表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，仙靈骨葆可改善骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨代謝，促進(jìn)骨痂形成，增加骨密度，提高骨生物力學(xué)性能，促進(jìn)骨折愈合，其作用機(jī)制可能與仙靈骨葆膠囊通過(guò)介導(dǎo)骨生長(zhǎng)因子BMP-2和IGF-1表達(dá)有關(guān)。雖然仙靈骨葆膠囊對(duì)OPF臨床及實(shí)驗(yàn)研究均取得較大的進(jìn)展，為防治OPF提供了新的思路，但中藥及其復(fù)方制劑成分及作用機(jī)制復(fù)雜，應(yīng)結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，將傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)辯證論治、整體調(diào)理的優(yōu)勢(shì)和現(xiàn)代西醫(yī)學(xué)理論充分結(jié)合起來(lái)，為臨床治療及新藥研發(fā)提供依據(jù)，推動(dòng)祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的可持續(xù)發(fā)展。