黃芪多糖對MC3T3-E1細胞增殖及成骨分化的影響

胡俊 楊盼盼 袁忠 談榮珍 張楚焌 張斌 沈云峰

1.南昌市洪都中醫院骨傷七科，江西 南昌 330008 2.南昌大學第二附屬醫院內分泌代謝科，江西 南昌 330006

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)為絕經后婦女常見的代謝性骨骼疾病，以骨量減少、骨折風險增加為主要特征，因此嚴重影響患者的健康及生活治療[1]。據我國最新的流行病學調查，在50歲以上的人群中有19.2 %的人患有骨質疏松癥，而在65歲以上的人群中，此患病率更是高達32.0 %[2]。作為抗骨質疏松常用手段，雙膦酸鹽類藥物常伴隨不良反應，如增加患乳腺癌風險或下頜壞死等[3-4]。因此，尋找更加安全可靠的治療藥物吸引了越來越多的學者關注，而中藥因其簡、便、驗、廉的特性，在世界上受到越來越多的關注[5]，其優異療效也被越來越多的研究所證實[6]。

黃芪中主要含有皂苷、黃酮、多糖類等活性成分，除優異的抗動脈硬化、抗細胞衰老作用之外，其提高性激素水平、調控骨代謝的作用也被逐漸被人們熟知[7]。研究發現黃芪水提液可有效促進骨質疏松大鼠的骨形成，同時抑制骨量丟失[8]。而現階段，關于黃芪多糖(astragalus polysaccharides，AP)對成骨細胞增殖、分化的潛在作用機制尚無深入的認識。因此本研究將分析探討不同濃度AP對MC3T3-E1細胞增殖及成骨分化的影響及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1成骨細胞：MC3T3-E1細胞購自于中國科學院上海細胞所細胞庫，第3代細胞用于后續實驗。

1.1.2材料與試劑 ：黃芪多糖(純度>98 %)從成都德思特生物技術有限公司購買；α-MEM培養基、胎牛血清、青鏈霉素、0.25 %胰蛋白酶從美國Gibco公司購買；β甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松、MTT試劑盒購買于美國Sigma公司；RIPA裂解液、ALP染色試劑盒、免疫熒光染色試劑盒、ECL曝光液從上海碧云天生物技術有限公司購買；茜素紅染色液從經賽業生物科技有限公司購買；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購買于日本Takara公司；Runx2、β-catenin、Osteocalcin抗體購自Santa Cruz 公司；β-actin、鼠二抗、兔二抗購自北京全氏金生物技術有限公司。全自動酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；電泳儀、電轉儀購自美國Bio-Rad 公司；倒置相差顯微鏡購自德國Leica公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；BX51熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養：將含有10 %胎牛血清、1 %青鏈霉素的α-MEM的基礎培養基配制后，用于后續的MC3T3-E1細胞系培養。細胞板均放置于37 ℃、5 % CO2的細胞培養箱。在細胞生長、融合至80 %～90 %時，使用胰蛋白酶消化及分瓶，用于后續實驗。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖：以每孔2 000個MC3T3-E1細胞接種于96孔板中，置于培養箱中生長24 h后，加入不同濃度的AP(0、5、10 μmol/L)進行干預，每組設3個復孔。使用MTT法在干預后的1、3、5、7 d檢測細胞活力。在每培養孔加入10 μL MTT試劑后，放置培養箱中避光孵育4 h，然后在酶標儀(570 nm波長)處測定每孔的吸光值。

1.2.3ALP及茜素紅染色：10-8mol/L 地塞米松、10 mmol/L β甘油磷酸鈉和50 μmol/L 抗壞血酸配制成成骨誘導液。MC3T3-E1細胞以5×104/孔的密度水平鋪板于24孔板中，24 h細胞貼壁后培養于成骨誘導液中。細胞按不同濃度的AP(0、5、10 μmol/L)干預而分組，每3天換液1次，14 d后進行ALP及茜素紅染色。ALP染色過程如下：棄置培養基后，細胞在裂解液作用下裂解，后續染色流程根據ALP試劑盒說明書實施。茜素紅染色過程如下：棄置舊培養液后，細胞經PBS反復清洗3次，然后加入4 %多聚甲醛固定細胞30 min，然后PBS沖洗固定液3遍后，取300 μL茜素紅染液于每孔細胞，室溫下靜置10 min后PBS沖洗染液3次，最后使用顯微鏡觀察每組染色情況。

1.2.4Real-time PCR檢測相關mRNA：以1×108/孔的密度種植于6孔板中，干預措施同1.2.3。細胞干預14 d后，根據RNA提取試劑盒說明書實施細胞總RNA提取，使用無RNA酶水溶解后測定濃度。擴增cDNA反應條件為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，一共40個循環。然后從PCR儀中獲取Ct值采用2-△△Ct 法，以GAPDH作為內參計算Runt相關轉錄因子2(Runx2)、β-連環蛋白(β-catenin)、骨鈣素(osteocalcin)、I型膠原蛋白(collagen I)的mRNA表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.5Western Blot檢測相關蛋白：以2×105/孔的密度種植于6孔板中，分組、干預方式同上，14 d后使用RIPA裂解細胞提取總蛋白，配置好10 %SDS-PAGE分離膠與5 %濃縮膠后，每組取20 μL樣本進行后續的電泳、轉膜、封閉步驟。Runx2(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、osteocalcin(1∶500)、β-actin(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜；室溫下孵育二抗(1∶2 000)2 h，TBST洗滌后ECL曝光。條帶表達情況使用Image J 軟件分析。

1.2.6免疫熒光測定β-catenin熒光強度：MC3T3-E1細胞以2×104/片的密度鋪于爬片，接受AP干預作用14 d后，在室溫下使用4 %的多聚甲醛室溫固定MC3T3-E115 min，接著用0.1 % Triton X破膜20 min。使用血清封閉20 min后，每孔加入β-catenin一抗(1∶200)放置于4 ℃孵育過夜；第二天使用熒光二抗(1∶150)室溫孵育2 h，然后加入DAPI避光孵育2 min，在暗光條件下使用熒光顯微鏡拍照。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 不同AP對MC3T3-E1增殖影響

MC3T3-E1細胞增殖隨著AP干預時間增加呈逐步上升趨勢，并與AP濃度呈正相關關系。與其他濃度比較，10 μmol/L AP在各時間點促細胞增殖效果更加明顯，且差異具有統計學意義；而干預1、5 d后5 μmol/L的AP促增殖效果與對照組對比的差異同樣有統計學意義。見圖1。

注：與0 μmol/L組同期對比，#*P<0.05。圖1 不同濃度AP對MC3T3-E1增殖影響Fig.1 Effects of AP at different concentrations on the proliferation of MC3T3-E1

2.2 不同濃度AP的促成骨分化效果觀察

ALP染色結果顯示AP干預14 d后，細胞的ALP染色陽性率明顯高于對照組(0 μmol/L)，且與濃度呈正相關關系，10 μmol/L AP的促成骨作用更佳。ARS染色結果與ALP染色結果相符合，10 μmol/L AP可有效提高染色陽性率。見圖2。

圖2 干預14 d后不同濃度AP的促成骨作用觀察Fig.2 Effects of AP at different concentrations on the osteogenic differentiation of MC3T3-E1

2.3 不同濃度AP對成骨相關mRNA表達影響

不同濃度AP干預14 d后，與對照組相比，5 μmol/L AP可有效提高Runx2、osteocalcin、collagen I mRNA的表達(P<0.05)；而10 μmol/L AP促進上述mRNA表達效果更加明顯(P<0.01)，同時還可以促進β-catenin mRNA表達 (P<0.01)。見圖3。

圖3 干預14 d后不同濃度AP對成骨分化標志物的調控作用觀察Fig.3 Effects of AP at different concentrations on osteogenic differentiation-related mRNA of MC3T3-E1 cells

2.4 不同濃度AP對成骨相關蛋白表達影響

結果顯示5 μmol/L AP的促進β-catenin、Osteocalcin、Runx2蛋白表達作用與對照組比較，差異無明顯統計學意義。而10 μmol/L AP則可促進β-catenin(1.024±0.056)、osteocalcin(1.498±0.025)、Runx2(0.873±0.038)蛋白的表達，差異具有統計學差異(P<0.05)。見圖4。

圖4 干預14 d后不同濃度AP對成骨分化相關蛋白的調控作用觀察Fig.4 Effects of AP at different concentrations on osteogenic differentiation-related proteins of MC3T3-E1 cells

2.5 10 μmol/L AP對β-catenin蛋白核移位的影響

與對照組(0 μmol/L AP)比較，10 μmol/L AP干預細胞14 d后，可有效促進β-catenin蛋白在細胞核內的表達。見圖5。

圖5 10 μmol/L AP對β-catenin蛋白核移位的影響(100×)Fig.5 Effects of 10μM AP on the nuclear translocation of β-catenin protein(100×)

3 討論

骨質疏松癥可因年齡增長、藥物使用、體內激素水平改變等因素而誘發，背后機制與骨形成與骨吸收之間的動態平衡被打破有關[9-10]。近年研究發現，中醫藥治療可有效改善骨質疏松引起的骨量丟失，其治療機制可能與上調骨形成、下調骨吸收過程有關[6,11]。Shen等[12]經體內外實驗研究發現虎杖苷可激活BMP2-Wnt/β-catenin信號通路，以及誘導TAZ表達以調控骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，因此有抑制骨質疏松小鼠骨量丟失的作用。Ornstrup等[13-14]通過給予患者口服白藜蘆醇治療16周后，發現治療組患者的腰椎骨密度、血ALP水平均明顯提高，其中機制與可能與上調了促骨形成的SIRT1蛋白有關。

黃芪雖為常用的補氣中藥，但其抗骨質疏松作用也逐漸受到關注、應用，并取得了令人滿意的療效[15]。成鵬等[16]發現在骨質疏松大鼠中，黃芪甲苷可明顯提高β-catenin以及Wnt2蛋白的表達量，并下調FoxO3a蛋白的表達，抑制氧化應激引起的骨量丟失。黃芪注射液靜滴、中藥黃芪口服可有效提高患者骨密度、改善骨代謝[17-18]。高糖環境對MC3T3-E1細胞的增殖以及成骨分化有負向調控作用，但AP逆轉高糖環境的不利影響[19]。

本研究結果表明，早期成骨標志物(ALP、Runx2)[20]，以及鈣沉積標志物(Collagen I)[21]均可被AP上調表達，并與AP濃度呈正相關關系，該部分結果與ALP、茜素紅染色結果一致，因此表明AP可以促進 MC3T3-E1的成骨分化和礦化。Western blot實驗結果也從蛋白表達層面驗證了這一趨勢。此外，我們還發現AP明顯促進了β-catenin蛋白的表達以及核易位。Wnt以及BMP均為調控細胞成骨分化的重要通路信號，前者可誘導間充質干細胞向成骨祖細胞分化[22]，而后者則可進一步促進祖細胞向成骨細胞分化[23]。而上述兩條成骨分化關鍵通路對β-catenin基因的轉錄表達，以及其蛋白翻譯、核易位過程均有促進作用，最終下游的促細胞增殖、成骨的相關基因的轉錄水平因此明顯增高[24]。所以，我們認為AP促進MC3T3-E1細胞增殖、成骨分化，可能與這些機制有關。

綜上所述，Wnt/β-catenin信號通路激活可能為AP促MC3T3-E1細胞增殖以及成骨分化的作用機制之一，但是本研究目前僅停留在細胞水平，缺少動物實驗結果支持，因此研究結果存在一定的局限性，后續將會完善體內相關實驗。