高劑量糖皮質激素對成年雄性小鼠PDGF-BB分泌及H型血管生長的作用研究

李素麗 詹先琴 張艷君 馬艷榮 王英 王燕

新疆維吾爾自治區人民醫院,新疆 烏魯木齊 830001

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量降低、骨脆性增加、骨強度下降、骨折風險性增加為特征的全身性、代謝性骨病[1]。在繼發性骨質疏松癥中，糖皮質激素性骨質疏松癥(glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)是臨床上常見的繼發性骨質疏松癥之一，多伴有骨質疏松或并發骨折。大量研究表明，超生理量的類固醇激素及其類似物對骨骼系統的發育、生長與細胞代謝有明顯不利影響。歐洲絕經后骨質疏松婦女指南已經明確將每日使用強的松龍5 mg、時間超過3個月或更長作為骨質疏松癥的臨床危險因素[2]。

目前GIOP治療的藥物多局限在雙膦酸鹽、性激素替代及重組甲狀旁腺素、抗RANKL單克隆抗體的治療上[2-4]，對于糖皮質激素性骨質疏松癥的病因還不是很清楚。本研究將探討長期高劑量糖皮質激素對成年雄性小鼠破骨前體細胞PDGF-BB分泌的影響以及對骨成長特異的H型血管生長的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:12只雄性3月齡C57小鼠，體重21～24 g [購于南京市江寧區青龍山動物繁殖場，許可證號：SCXK(蘇)2017-0001]。

1.1.2實驗儀器及試劑小動物Micro-CT儀(德國Bruker公司SkyScan 1176)；冰凍切片機(LEICA CM1950)；熒光顯微鏡(日本尼康Nikon Eclipse TS2R)；成像系統(日本尼康Nikon DS-Ri2)；強的松龍[愛必信(上海)生物科技有限公司，CAS號：83-43-2]；rhPDGF-BB(peprotech，100-14B)；Mouse PDGF-BB ELISA kit(cusabio，CSB-E08925)；Mouse Osteocalcin ELISA試劑盒(cusabio，CSB-E06917 m)；Mouse BSAP ELISA試劑盒(cusabio，CSB-E11914 m)；Mouse PINP ELISA試劑盒(cusabio，CSB-E12775 m)；Mouse CTX-1 ELISA試劑盒(cusabio，CSB-E12782 m);PBS(南京生興生物)；TRAP(solarbio，G1492)；CD31(abcam，ab24590)；Endomucin(abcam，ab106100)。

1.2 方法

1.2.1實驗分組及處理：12只C57小鼠被隨機分為兩組，每組各6只。GIOP組通過腹腔注射強的松龍(10 mg/m2)，每天一次，持續四周。BSA(體表面積)=k*W2/3，k=9.82，w=body weight；對照組通過腹腔注射等量的PBS。

1.2.2標本取材及處理：分別取各組小鼠外周血1 mL。將外周血置于冷凍離心機, 4 500 r/min，4 ℃離心10 min，取上清部分做ELISA檢測。測定骨形成標志物骨鈣素(osteocalcin ,OC)、骨特異性堿性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase ,BSAP)、膠原氨基酸延長肽I(aminoterminal propeptide of type I procollagen，PINP)及骨吸收標志物：血清C端交聯肽(serum C-telopeptide，CTX)。測定血小板衍化生長因子(platelet drive growth factor-BB, PDGF-BB)。解剖分離小鼠股骨，剪開股骨兩端，用500 μL滅菌生理鹽水反復沖洗小鼠股骨干，冷凍離心機4 500 r/min，4 ℃離心10 min，取上清部分做ELISA檢測，測定骨髓上清PDGF-BB水平。取C57小鼠股骨行Micro-CT掃描。將股骨制成80 μm厚的冰凍切片，行CD31hiEmcnhiH型血管免疫熒光染色。分別取各組小鼠外周血1 mL。將外周血置于冷凍離心機, 4 500 r/min，4 ℃離心10 min，取上清部分做ELISA檢測。測定骨形成標志物骨鈣素(osteocalcin ,OC)、骨特異性堿性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase ,BSAP)、膠原氨基酸延長肽I(aminoterminal propeptide of type I procollagen，PINP)及骨吸收標志物：血清C端交聯肽(serum C-telopeptide，CTX)。測定血小板衍化生長因子(platelet drive growth factor-BB, PDGF-BB)。解剖分離小鼠股骨，剪開股骨兩端，用500 μL滅菌生理鹽水反復沖洗小鼠股骨干，冷凍離心機4 500 r/min，4 ℃離心10 min，取上清部分做ELISA檢測，測定骨髓上清PDGF-BB水平。取C57小鼠股骨行Micro-CT掃描。將股骨制成80 μm厚的冰凍切片，行CD31hiEmcnhiH型血管免疫熒光染色。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 血清中BSAP、CTX-1、OC和PINP的表達

相對于對照組，GIOP組血清中CTX-1(P=0.000 3)表達上升，BSAP(P=0.000 01)、OC(P=0.001 3)和PINP(P=0.005 9)表達下降，見圖1。

圖1 血清中BSAP、CTX-1、OC和PINP的表達Fig.1 The expression of BSAP, CTX-1, OC and PINP in serum

從股骨Micro CT結果中可以看出，GIOP組相對于對照組，骨量減少, Tb.Th即小梁骨厚度有顯著差異(P=0.000 6)，見圖2、表1。

表1 股骨Micro CT結果Table 1 Results of femur bone micro CT

圖2 股骨Micro CT結果Fig.2 Results of femur bone Micro CT

從腰椎骨Micro CT結果(圖3、表2)中可以看出，GIOP組相對于對照組，骨量明顯減少。主要在TV(P=0.020 5)、BV(P=0.003 2)、Tb.N(P=0.039 9)和 BMD方面有統計學意義(P=0.031 2)。

圖3 腰椎Micro CT結果Fig.3 Results of lumbar bone micro CT

表2 腰椎Micro CT結果Table 2 Results of lumbar spine micro CT

相對于對照組，GIOP組血清和骨髓中的PDGF-BB表達明顯下降，CD31和Endomucin 表達均有所下調，見圖4、圖5。

圖4 血清和骨髓中PDGF-BB的表達Fig.4 The expression of PDGF-BB in serum and bone marrow

圖5 H血管CD31和Endomucin表達Fig.5 CD31 and Endomucin expression of H type blood vessels

3 討論

GIOP的發生具有一定的異質性[5]。一般來說，根據BMD的測定結果來看，在使用糖皮質激素一年之內，患者骨量快速丟失比例為6%～12%。此后，隨著治療的進行，每年依次丟失骨量3%[6]。在糖皮質激素短期高劑量、長期中等劑量和一次關節腔內注射就可以引起股骨頸或肱骨近端無菌性壞死，發生率為25%[7]。

由于糖皮質激素不可替代的作用，在臨床工作中被廣泛使用。在炎性和免疫性疾病中，包括風濕性關節炎、炎癥性腸病、腎病綜合征會在全身性使用[8]。在皮炎、哮喘、結膜炎等疾病中會被局部使用。而在急性炎癥反應如休克、腦水腫和移植術后會使用高劑量的糖皮質激素[9]。在2019年對于新冠病毒的治療中，也有不同程度的使用[10]。長期使用糖皮質激素，將不可避免的出現骨量減少、骨質疏松或骨質壞死。

糖皮質激素通過多種途徑影響骨代謝，抑制成骨，增加骨吸收，最終導致骨量的丟失。目前已知的具體機制如下：①糖皮質激素誘導骨細胞程序性死亡，加速成骨細胞凋亡；②促使骨基質細胞分化為脂肪細胞，從而減少骨細胞數量[11]；③通過直接抑制睪丸和卵巢及促性腺激素的釋放，抑制性激素的合成，雄、雌激素的減少進一步加重骨量丟失；④通過影響鈣在腸道和腎臟的代謝、轉運，使尿鈣增加、腸鈣吸收明顯減少，鈣流失增多；⑤刺激甲狀旁腺素的合成、分泌和釋放，誘導骨質疏松的發生。本課題組前期的研究認為骨微環境尤其是微血管數目的減少，是GIOP的一個重要原因，糖皮質激素可能影響了與這些細胞及器官組織有關的血管聯系，破壞骨形成的微環境[12]，從而導致骨質疏松或骨量減少。

骨組織血管豐富，有廣泛的大血管和毛細血管網絡交織。破骨細胞的作用并不是簡單的理解為促進骨吸收的因素。它與成骨細胞、血管生成偶聯，起到促進新生血管生成的作用。骨穩態的維持和新骨的生成與血管生成密不可分。H型血管是科學家們發現的對CD31 和Endomucin (Emcn)高表達的骨特異性血管，H型血管內皮細胞分泌成骨轉錄因子Osterix。研究[13-14]證明隨著年齡增長尤其是在老齡小鼠骨中，隨著骨前體細胞和骨質量的減少，H型血管明顯減少，在這點上，老年性骨質疏松癥可能也有相似的發病機制。

血小板衍化生長因子(platelet drive growth factor, PDGF )是一組生長因子，調節細胞生長和分化，尤其是在血管生成方面作用顯著。主要由體內單核/巨噬細胞合成。一般認為，PDGF源于間充質干細胞，包括纖維母細胞、平滑肌細胞和膠質細胞，儲存在血小板α顆粒中，在血小板被激活后釋放。PDGF分成AA/AB/BB三種具有生理活性的形式，其中BB型式更能促進纖維母細胞的生長。作為巨噬細胞的趨化因子[15]，促進血管新生和動脈生成[16]，體內研究證實，這一過程早于血管的萌芽和神經血管的生成[17-20]。

本研究在糖皮質激素誘導的小鼠骨質疏松癥模型中，證明使用4周糖皮質激素會使PDGF-BB明顯下降，出現骨量降低[18]。謝輝等[19]的研究證實了在卵巢切除小鼠中骨H型血管減少,而外源性的注射PDGF-BB 或cathepsin K阻滯劑可以增加破骨前體細胞數量，PDGF-BB的升高可以提高H型血管的數量，促進卵巢切除小鼠的骨形成。他們的研究提示在骨髓中PDGF-BB約有72.6%始自TRAP+的細胞分泌(主要為破骨前體細胞)，12.6%由內皮細胞分泌，14.8%源自其他細胞。最近的研究[18]也證實，骨血流量的多少進一步控制了骨的功能血管生成和骨的生成。

經過Micro-CT測定，地塞米松使用3周(相當于人類的3～4年)使小鼠股骨遠端小梁骨的厚度及數量明顯減少[21]。本研究進一步證實長期高劑量糖皮質激素對成年小鼠破骨前體細胞PDGF-BB分泌及對骨成長特異的H型血管生長均具有抑制作用，相對于對照組，GIOP組血清和骨髓中的PDGF-BB表達明顯下降；GIOP組血清中CTX-1表達上升，BASP、OC和PINP表達下降。

當然，本研究也存在一定的不足。在后續研究中需要進一步通過PDGF-BB局部穿刺注射治療動態觀察骨的代謝產物和H型血管的變化。另外，對于使用糖皮質激素4周的C57小鼠模型，從股骨Micro CT結果中看到GIOP組相對于對照組骨量減少，以小梁骨厚度有顯著差異為主(P=0.000 64)；在腰椎骨的組織量(P=0.020 5)、骨量(P=0.003 2)、骨小梁數(P=0.039 9)、骨密度方面(P=0.031 2)有統計學意義。但以股骨為代表的皮質骨、以腰椎為代表的松質骨為什么會對糖皮質激素的應答不一致，目前還未得出結論，今后應在這方面進一步展開研究與探討。