靜電紡絲結合熱誘導交聯制備的抗菌吸水襯墊對冷鮮肉的保鮮效果

于 棟，常婧瑤，陳佳新，王 浩，孔保華，夏秀芳，劉 騫

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

冷鮮肉是指對嚴格執行獸醫衛生檢疫制度屠宰后的畜體迅速進行冷卻處理，使肉溫在24 h內降為0～4 ℃的生鮮肉，也稱之為排酸肉、預冷肉[1]。冷鮮肉因其具有鮮嫩、美味、安全、衛生等優點而深受消費者喜愛[2]。普通有氧托盤包裝是超市小塊分割肉展銷的常用包裝方式，該包裝方式簡潔方便[3]。但是冷鮮肉存放一段時間后會滲出大量肉汁降低冷鮮肉感官品質，此外，肉汁積聚于托盤底部會導致微生物快速繁殖使冷鮮肉產生異味，縮短貨架期，嚴重影響商業價值[4-6]。目前無塵紙吸水墊被廣泛應用于托盤包裝冷鮮肉的貯藏過程中，其是以全木漿纖維為原料采用氣流成網的技術制備的非織造布，在制作過程中使用空氣作為分散和輸送纖維的介質，依靠高分子粘合劑或熱熔性纖維本身熔融結合使纖維固定在網簾上制成[7]。然而無塵紙吸水墊的生產工藝相對復雜，并且不能有效抑制微生物生長繁殖。

近年來，靜電紡絲技術作為一種納米纖維膜的制備方法在食品領域備受關注。在紡絲的過程中聚合物溶液受到電場力的作用被拉伸固化，最終在接收裝置表面形成一層納米纖維膜[8-9]。通過靜電紡絲技術制備的吸水墊具有良好的包埋特性且孔隙率、比表面積大[10-11]，可作為一種新型吸水保鮮材料應用于冷鮮肉保鮮領域。利用靜電紡絲技術制備的吸水墊具有較高的吸水溶脹能力，但是其空間結構穩定性較低，因此在成膜的過程中通常結合熱誘導交聯技術來提高靜電紡絲吸水墊的結構穩定性。Dharmalingam等[12]以檸檬酸（citric acid，CA）為交聯劑，利用熱誘導原位交聯的方式制備羧甲基纖維素鈉/羥丙基甲基纖維素水凝膠膜，研究結果發現CA交聯可以提高水凝膠膜在水中的穩定性。Cumming等[13]以CA為交聯劑制備了膠原蛋白納米纖維膜，其結果表明交聯處理可以顯著提高膠原蛋白在水中的穩定性。López-Córdoba等[14]以CA為交聯劑制備了淀粉/聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）生物復合膜，研究表明該方法是制備淀粉基活性食品包裝材料的有效途徑。

本實驗基于靜電紡絲技術結合熱誘導交聯的方式制備了具有高吸水性的抑菌吸水墊。首先研究無塵紙吸水墊和不同CA交聯濃度下靜電紡絲吸水墊的溶脹性和溶脹損失，為進一步研究靜電紡絲技術的優勢，將具有抑菌作用的丁香精油包埋到靜電紡絲吸水墊中，在4 ℃條件下使用無塵紙吸水墊和靜電紡絲抑菌吸水墊分別對冷鮮肉進行包裝保鮮處理，比較10 d內兩種吸水墊包裝的冷鮮肉菌落總數、pH值、總揮發性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、顏色和揮發性氣味等。以期為將靜電紡絲抑菌吸水墊應用于冷鮮肉貯藏保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬里脊肉購自哈爾濱比優特超市；市售生鮮無塵紙吸水墊購自上海通貝吸水材料有限公司。

平板計數瓊脂 青島高科園海博生物技術有限公司；CA 國藥集團化學試劑有限公司；聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA） 上海邁瑞爾化學技術有限公司；丁香油（clove oil，CO） 中國雙香助劑廠。

1.2 儀器與設備

DFS-001高壓靜電紡絲機 北京新凱偉科技有限公司；SU8010掃描電子顯微鏡 日本日立集團；JEM-1230透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；Nicolet iS-50傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司；RW20機械攪拌機 德國IKA公司；電子分析天平北京賽多利斯儀器系統有限公司；水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；ZE-6000型色差儀 日本登宿株式會社；PEN3便攜式電子鼻氣味分析儀 德國AIRSENSE公司。

1.3 方法

1.3.1 靜電紡絲吸水墊的制備

配制紡絲溶液：首先稱取1.5 g PVA粉末，加雙蒸水定容至20 mL，85 ℃水浴加熱20 min，攪拌至完全溶解配制成75 g/L的PVA溶液。然后加入PVA質量0、3%、6%、9%、12%的CA，配制成混合溶液。將0.3 g CO加入到PVA/9% CA混合溶液中，最終紡絲溶液中CO的含量為20%（以PVA質量計）。

靜電紡絲吸水墊的制備：將所得紡絲溶液移至10 mL注射器中，靜電紡絲吸水墊的制備采用電壓調節直流電源，施加電壓為15 kV，進樣速率為0.24 mL/h，接收距離為12 cm。然后將收集得到的納米纖維進行加熱處理，加熱條件為130 ℃、8 min，最終得到酯化交聯的靜電紡絲吸水墊。

圖1 靜電紡絲吸水墊制作流程圖Fig. 1 Flow chart for the preparation of hygroscopic pads by electrospinning

1.3.2 靜電紡絲吸水墊結構與性質測定

1.3.2.1 傅里葉變換紅外光譜測定

采用傅里葉變換紅外光譜儀測量納米纖維的紅外吸收光譜，光譜范圍500～4 000 cm－1，掃描次數64。

1.3.2.2 溶脹率和溶脹損失率測定

溶脹率和溶脹損失率的測定采用Mayachiew[15]、Khoshgozaran-Abras[16]等的方法。首先將干燥至恒質量的樣品剪成相同大小（3 cm×3 cm）并稱量其質量（m0/mg），然后將樣品置于30 mL的蒸餾水中浸泡24 h，測溶脹率時用濾紙將樣品表面水分吸干后稱量其質量（m1/mg）；測溶脹損失率時，將浸泡24 h的樣品在105 ℃下烘干至恒質量（m2/mg）。溶脹率和溶脹損失率分別按公式（1）、（2）計算。

1.3.2.3 微觀結構觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察靜電紡絲吸水墊的形貌結構，其中放大倍數為10k，加速電壓為5 kV，工作距離為10 mm。觀察吸水前的吸水墊樣品時，樣品不用進行前處理，觀察吸水后吸水墊時需要預先將樣品凍干處理。測定納米纖維直徑時首先選取平行樣品的掃描電子顯微鏡照片，然后利用ImageJ軟件對圖像進行整體分析，纖維直徑取各平行樣品的平均值。采用透射電子顯微鏡觀察包埋CO后的靜電紡絲吸水墊形貌，加速電壓為100 kV。

1.3.3 豬肉保鮮實驗

1.3.3.1 原料處理

將購買的新鮮豬里脊肉切成相同大小的肉塊（4 cm×4 cm×4 cm）分別放置于托盤包裝盒中，設置3 組實驗，空白組不使用吸水墊，無塵紙吸水墊組使用市售吸水墊，靜電紡絲吸水墊組使用PVA/9% CA/20% CO的抑菌吸水墊。將樣品置于4 ℃條件下貯藏，分別在冷藏過程中的第0、2、4、6、8、10天各取樣一次，測定肉中菌落總數、pH值、TVB-N含量以及豬肉在貯藏過程中外觀品質的變化。

1.3.3.2 菌落總數的測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[17]進行測定。

1.3.3.3 pH值的測定

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》[18]進行測定。

1.3.3.4 TVB-N含量的測定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》中的半微量定氮法[19]進行測定。

1.3.3.5 顏色測定

利用色差儀測定豬肉樣品的亮度L*值、紅綠度a*值和黃藍度b*值。使用色差儀前，用配套黑板和白板進行校正。擦干肉樣表面水分，并將其置于色差杯中進行樣品測定。每個樣品選取3個不同位置進行測定，重復測定3個樣品，結果取平均值。并用相機在相同環境下對貯藏期內豬肉樣品（單獨的3 cm×3 cm×2 cm樣品用于拍照）進行拍照記錄。

1.3.3.6 電子鼻測定揮發性氣味

準確稱取6 g切碎后的樣品置于頂空密封瓶中，室溫下放置30 min使其頂部空間揮發性物質達到平衡狀態，使用便攜式電子鼻氣味分析儀進行測定，每個樣品進行3 次平行實驗，每個處理重復3 次。

電子鼻檢測參數：傳感器自清洗時間100 s；傳感器歸零時間10 s；進樣流量300 mL/min；分析測試時間90 s。電子鼻10 種傳感器的性能描述見表1。

表1 PEN3電子鼻傳感器敏感物質Table 1 PEN3 electronic nose sensors sensitive to various volatile substances

1.4 數據統計與分析

所有實驗進行了3 次獨立實驗，結果表示為平均值±標準差。數據統計分析采用Statistix 8.1軟件包中的Linear Models程序進行，差異顯著性分析使用Tukey HSD檢驗程序，P＜0.05表示差異顯著。采用Sigmaplot 12.5軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 靜電紡絲吸水墊的結構與性質

2.1.1 傅里葉變換紅外光譜分析結果

圖2為靜電紡絲吸水墊的傅里葉變換紅外光譜圖。純PVA納米纖維的特征吸收峰分別為：3 384 cm-1（O—H伸縮振動）、2 940 cm-1（烷基C—H）、1 436 cm-1（CH2彎曲振動）和1 094 cm-1（C—O伸縮振動）。經3%、6%、9%、12% CA交聯的納米纖維在1 716 cm-1左右出現了新的COO—特征峰，并且隨著CA添加量的增加，酯基的特征峰強度逐漸加強。這證明PVA的羥基與CA的羧基之間會發生酯化交聯反應形成酯基。Kanatt等[20]利用CA交聯羧甲基纖維素/PVA制備耐水性活性包裝得到了相似的結果，他們發現隨著CA濃度的增加，在1 734 cm-1處的酯基特征峰強度加強。

圖2 靜電紡絲吸水墊的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of electrospun hygroscopic pads

2.1.2 溶脹率與溶脹損失率

吸水墊的溶脹能力反映了吸水墊的吸水能力[21]。表2顯示了無塵紙吸水墊和靜電紡絲吸水墊的溶脹率和溶脹損失率。未交聯的靜電紡絲吸水墊遇水后結構發生破壞，溶脹損失率達到100%，無法研究其溶脹率。交聯靜電紡絲吸水墊的溶脹率都在400%以上，顯著高于無塵紙吸水墊的溶脹率（264%），說明其具有更高的吸水能力。這可能是因為它們的三維納米結構更有利于水分子進入。此外，交聯后靜電紡絲吸水墊的溶脹率隨CA添加量的增加而降低，這一現象可能是因為交聯程度隨CA添加量的增加而增大，進而使得吸水墊中親水基團數量減少，導致靜電紡絲吸水墊吸水能力下降。這與Zou Guoxiang等[22]的研究結果一致，他們在研究中提出淀粉膜的溶脹率隨著交聯劑添加量的增加而降低。

溶脹損失率是體現薄膜耐水性的一個重要指標。水溶性較低的包裝膜可以在包裝中保持自身的完整性，尤其適合應用在含水量較高的食品中。如表2所示，無塵紙吸水墊由于材料原因，幾乎沒有溶脹損失，而靜電紡絲吸水墊溶脹損失率隨著CA添加量的增加而降低，這是因為交聯過程使得吸水墊的結構更穩定，從而使溶脹損失率降低。這與Shi Rui等[21]利用CA交聯PVA/淀粉膜的研究結果一致。總結來看，在實際應用過程中要求活性食品包裝具有更高的溶脹率和水穩定性，因此本研究選擇了9% CA交聯的靜電紡絲吸水墊進行下一步實驗。

表2 市售吸水墊和不同CA添加量的靜電紡絲吸水墊的溶脹率和溶脹損失率Table 2 Comparison of swelling rates and swelling loss rates between commercial hygroscopic pads and electrospun hygroscopic pads with different citric acid contents

2.1.3 靜電紡絲吸水墊的微觀結構

從圖3A可以看出，納米纖維形態光滑均一，纖維呈無規則分布，這使得靜電紡絲吸水墊具有高孔隙率以及高比表面積。從圖3B可以看出，靜電紡絲吸水墊吸水后呈現溶脹狀態，纖維與纖維之間的孔隙率降低，但吸水墊結構完整，無破損情況。這也表明利用CA作為交聯劑提高PVA的耐水性是一種切實可行的辦法，同時與紅外光譜結果相印證。從圖3C可以看出，總體上纖維直徑分布比較集中，100～150 nm的纖維比重最大，其次是150～200 nm。圖3D是納米纖維包埋CO后的透射電子顯微鏡圖，可以看到在纖維中出現“囊泡”的結構，這說明CO被成功包埋到納米纖維中。

圖3 靜電紡絲吸水墊的微觀結構Fig. 3 Microstructure of electrospun hygroscopic pads

2.2 PVA/9% CA/20% CO的抑菌吸水墊對豬肉貯藏過程中的品質影響

2.2.1 菌落總數

研究表明，新鮮肉菌落總數低于4.0（lg（CFU/g）），次鮮肉菌落總數為4.0～6.0（lg（CFU/g）），變質肉菌落總數超過6.0（lg（CFU/g））[23]。由圖4可知，在冷藏過程中空白組菌落總數的增長速度明顯高于無塵紙吸水墊組和靜電紡絲吸水墊組。冷藏至第6天時，空白組中冷卻豬肉菌落總數已超過了6.0（lg（CFU/g）），而無塵紙吸水墊組和靜電紡絲吸水墊組分別為5.55（lg（CFU/g））和5.13（lg（CFU/g）），顯著低于空白組（P＜0.05）。隨著冷藏時間的延長，無塵紙吸水墊組和靜電紡絲吸水墊組的菌落總數呈上升趨勢，分別在第8天和第10天時，樣品菌落總數超過6.0（lg（CFU/g））。在本研究中，空白組未經任何處理，冷鮮肉中流出的肉汁積聚在托盤內部，加速了微生物的繁殖，導致冷鮮肉腐敗更快。相比于空白組，雖然無塵紙吸水墊可以提高托盤包裝衛生條件，但保鮮效果不佳，可能是因為無塵紙吸水墊的吸水能力較低。在靜電紡絲吸水墊組中，靜電紡絲吸水墊吸收肉汁能力更強，并且當靜電紡絲吸水墊發生溶脹時，可以釋放出具有抑菌和抗氧化作用的CO至鮮肉表面[24-25]。二者的聯合使用能增加吸水墊的保鮮能力，降低鮮肉中細菌的生長速率。故靜電紡絲吸水墊的冷藏保鮮效果更加明顯。

圖4 不同吸水包裝材料對冷藏過程中豬肉菌落總數的影響Fig. 4 Effects of different hygroscopic packaging materials on total viable count in chilled meat during storage

2.2.2 pH值

如圖5所示，3 組豬肉樣品的pH值隨冷藏時間的延長均呈現先下降后上升的趨勢。在第2天時3 組樣品的pH值無顯著性差異，說明9% CA和PVA完全酯化交聯后，不會影響pH值，這與Kanatt等[20]的研究結果相似。在第4天和第6天時，靜電紡絲吸水墊組的pH值顯著低于空白組和無塵紙吸水墊組（P＜0.05）。到第10天時，空白組pH值和無塵紙吸水墊組pH值無顯著差異（P＞0.05），但靜電紡絲吸水墊組pH值仍顯著低于空白組和無塵紙吸水墊組（P＜0.05）。3 組樣品pH值在前期下降可能是因為宰后肌肉中的肌糖原經過糖酵解過程不斷被分解，最終產生乳酸[26]。隨著冷藏時間的延長，細菌大量繁殖產生的蛋白酶使蛋白質分解生成堿性的胺類等物質，從而使后期pH值不斷上升[27]。

圖5 不同吸水包裝材料對冷藏期內冷鮮肉pH值的影響Fig. 5 Effects of different hygroscopic packaging materials on pH of chilled meat during storage

2.2.3 TVB-N含量

在酶和細菌的作用下，冷藏過程中肉的蛋白質被分解而產生氨以及胺類等堿性含氮物質，這些物質被稱為揮發性鹽基氮[28]。因此，TVB-N含量可以作為評價肉類新鮮度的重要參考指標。如圖6所示，3 組豬肉樣品的TVB-N含量隨冷藏時間的延長均呈現上升趨勢。在同一冷藏時間，空白組TVB-N含量整體上顯著高于無塵紙吸水墊組和靜電紡絲吸水墊組（P＜0.05）。依據GB/T 9959.2—2008《分割鮮、凍豬瘦肉》，鮮肉的TVB-N含量應不高于15 mg/100 g。在冷藏第8天時，空白組和無塵紙吸水墊組冷卻肉的TVB-N含量已超過15 mg/100 g，并且在感官上有強烈的酸腐味道，而在冷藏第10天時，靜電紡絲吸水墊組的TVB-N含量才剛達到15 mg/100 g。因此，靜電紡絲吸水墊的吸水抑菌雙重作用可以較好地減緩TVB-N生成速度，減緩蛋白質氧化。

圖6 不同吸水包裝材料對冷藏期內冷鮮肉TVB-N含量的影響Fig. 6 Effects of different hygroscopic packaging materials on TVB-N content in chilled meat during storage

2.2.4 色澤變化

鮮肉表面顏色是衡量鮮肉品質的重要指標。如表3所示，3 組樣品L*值和a*值均隨冷藏時間的延長而顯著降低，b*值呈現緩慢上升的趨勢。與空白組和無塵紙吸水墊組相比，靜電紡絲吸水墊可以有效地降低L*值和a*值的下降速率。在冷藏過程中冷鮮肉顏色改變與血紅蛋白氧化有關，細菌污染和脂肪氧化會導致鮮肉中血紅蛋白逐漸被氧化為高鐵肌紅蛋白[29]。因此，包埋CO的靜電紡絲吸水墊能有效抑制鮮肉中血紅蛋白的氧化，從而延緩鮮肉色澤變化，提高其感官品質。

表3 冷鮮肉在冷藏過程中L*值、a*值和b*值的變化Table 3 Changes in color characteristics (L*, a* and b* values) of chilled meat during storage

豬肉在冷藏過程中的外觀變化如圖7所示。隨著冷藏時間的延長，各組豬肉樣品的顏色逐漸加深，并且空白組豬肉樣品顏色加深的速度比無塵紙吸水墊組和靜電紡絲吸水墊組快，到第4天時，空白組和無塵紙吸水墊組豬肉樣品表面開始發黏，汁液流失，顏色明顯深于靜電紡絲吸水墊組，而靜電紡絲吸水墊到第6天仍能保持良好的感官品質。冷鮮肉外觀變化與上述色差結果一致，這說明包埋CO的靜電紡絲吸水墊在延長冷鮮豬肉貨架期方面具有一定的應用前景。

圖7 冷鮮肉在冷藏過程中的外觀變化Fig. 7 Appearance changes of chilled meat during storage

2.2.5 揮發性氣味

冷鮮肉腐敗過程往往伴隨著異味的產生，氣味常被消費者用作鑒別冷鮮肉品質好壞的指標[30]。利用電子鼻技術可以檢測冷鮮肉在冷藏期間產生的揮發性氣味。圖8顯示，冷藏前2 d，3 組樣品電子鼻10個傳感器的響應值變化不大，說明冷鮮肉的揮發性氣味物質產生較少；隨著冷藏時間延長，空白組中傳感器W1W、W6S、W5S和W1S的響應值逐漸增加，說明冷藏過程中產生了硫化物、氫化物、氮氧化合物和烷類物質，其中空白組冷鮮肉品質下降最為明顯，尤其是W1S的響應值增加特別明顯，第10天較第0天增加了625%，說明冷鮮肉冷藏過程中烷類是風味變化最明顯的成分；冷藏至第6天時，靜電紡絲吸水墊組中各傳感器的響應值明顯低于無塵紙吸水墊組和空白組，且上升速率較為平緩。由傳感器W1W的響應值可以看出，靜電紡絲吸水墊組可以降低硫化物的生成，說明抑菌吸水墊可以有效抑制揮發性氣體的產生，對延緩冷鮮肉品質變化的作用最為明顯。此外，揮發性氣味物質變化規律與冷鮮肉TVB-N含量的變化趨勢基本一致，即冷藏4 d后空白組和無塵紙吸水墊組指標值急劇增加，而靜電紡絲吸水墊組增加相對平緩，保鮮效果較好。

圖8 冷藏過程中冷鮮肉氣味傳感器響應雷達圖Fig. 8 Radar map of sensor responses to chilled meat during cold storage

對電子鼻測定結果進行主成分分析（principal component analysis，PCA），結果如圖9所示。PCA是借助矩陣運算，對高維變量空間進行降維處理，然后將測定對象進行線性分類，最終以第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的二維散點圖形式將原始數據中的主要信息呈現出來的一種多元統計分析方法[31]。圖9顯示，空白組、無塵紙吸水墊組和靜電紡絲吸水墊組的累計貢獻率（PC1+PC2）分別為98.588%、96.479%和98.916%，說明2個主成分均可以較好地反映3 組樣品的多指標信息。從圖9可以看出，空白組和無塵紙吸水墊組第4天和第6天散點位置距第0天較遠，說明氣味差異較大；而靜電紡絲吸水墊組樣品的散點位置相距第0天相對較近，說明冷鮮肉保鮮后在冷藏過程中揮發性氣味成分變化較小，品質較為穩定。

圖9 冷藏過程中冷鮮肉氣味電子鼻響應值的PCA圖Fig. 9 Principal component analysis of electronic nose responses to the volatile flavor of chilled meat during cold storage

3 結 論

本實驗基于靜電紡絲技術利用CA熱誘導交聯的方式制備了具有高吸水性和抑菌性的靜電紡絲吸水墊，靜電紡絲吸水墊的溶脹率都在400%以上，顯著高于無塵紙吸水墊，說明靜電紡絲結合熱誘導交聯技術在制備食品吸水墊方面具有較大潛力。豬肉4 ℃保鮮實驗結果表明，靜電紡絲抑菌吸水墊可有效抑制冷鮮肉細菌生長和揮發性氣味產生，延緩冷鮮肉TVB-N含量和pH值增加，顯示其有一定的抗菌能力。同時，靜電紡絲抑菌吸水墊對冷鮮肉具有良好的護色效果，可延緩冷鮮肉的氧化變色。因此，本實驗制備的靜電紡絲抑菌吸水墊可延長托盤包裝冷鮮肉的貨架期，同時不會對冷鮮肉的品質產生不良影響。