MDCK過表達SV40-LT基因穩定細胞系的構建

劉文凱，田 玲，喬自林，王家敏，王明明，李 鈾*

（1.西北民族大學 生物醫學研究中心 甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730100）

體外培養的細胞增殖能力十分有限，細胞的每次分裂都會造成端?？s短，最終達到“Hayflick界限”，在大約60個PDs（群體倍增次數）后停止生長，當端粒太短而不能正常封頂時，復制性衰老（M1期，細胞生長停滯）就會發生[1]。細胞永生化可在M1期利用hTERT、病毒、放射性因素等阻止衰老，使細胞繼續增殖[2]。細胞在經過20～30次的PDs后，進入危機期（M2期），端粒酶被激活并反轉錄DNA來延長端粒，使細胞越過M2期并無限增殖，從而變為永生化細胞[3]。

細胞衰老打開DNA損傷反應通路，腫瘤抑制因子p53被激活，進而導致細胞周期停滯。SV40屬于猿猴病毒40，由結構蛋白（VP1，VP2，VP3）以及兩種抗原（LT，st）構成[4]，是建立永生化細胞系最直接的基因。SV40的表達可使LT與p53結合，從而致使p53失活，使其蛋白降解，最終有效促進細胞增殖并永生化。

1958年Madin和Darby從犬的腎臟中獲得上皮細胞產生了MDCK細胞系[5]，經檢測MDCK細胞產毒效力較高，可適用于生產甲型及乙型流感病毒[6]。但MDCK細胞對脂質體轉染的方式不夠敏感，所以要利用SV40病毒介導的感染方式使其具有較高的轉化率[7]。

本試驗利用慢病毒將SV40-LT基因導入MDCK細胞，通過篩選檢測到SV40-LT基因的表達，不僅探究了建立成熟永生化實驗體系的過程，為后續原代永生化細胞系提供技術依據，而且提高了MDCK細胞的增殖能力，可為疫苗生產提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

所用儀器包括生物顯微鏡、液氮罐、高壓滅菌器、恒溫水浴箱、冰箱、3 ml塑料細管、載玻片、蓋玻片、10 ml移液管、CO2培養箱、共聚焦顯微鏡、基礎電泳儀電源、小型轉印槽、垂直電泳儀、細胞凍存盒、反轉錄試劑盒、總RNA提取試劑盒、DMEM/F12培養基、新生牛血清、0.25%胰蛋白酶、嘌呤霉素、SV40-LT病毒液，其余試劑均為實驗室常規試劑。

1.2 細胞傳代

按照細胞長勢情況，加入5 ml新鮮培養基進行培養，待細胞生長至85%以上時進行傳代培養，觀察并拍照，記錄細胞的生長形態與速度。重點記下F3、F10、F15代細胞的形態，并做生物學研究[8]。為了提高細胞的貼壁能力，可以先利用0.5 ml新生牛血清浸濕T25細胞培養瓶的底部，將培養瓶倒置放入CO2培養箱培養0.5 h。

傳代時先對細胞瓶口消毒，倒去陳舊培養基，PBS溶液清洗3次后棄去，再向瓶內加入2 ml 0.25%胰蛋白酶，以覆滿瓶底為限，置恒溫培養箱中1～3 min。當發現細胞變圓、間隙變大后，棄去胰酶，用10 ml移液管緩緩吹打細胞底部把細胞吹下，形成細胞懸液[9]。按照1∶3的比例把細胞懸液分為3份加入細胞瓶中，并放在培養箱（37℃，5%CO2）中繼續培養。

1.3 細胞凍存與復蘇

凍存前24 h更換新鮮培養液，對數期細胞達到85%以上時進行細胞凍存，棄去培養基，加入PBS溶液清洗3次，加入胰酶消化1.5 min后，以800 r/min的速度離心10 min，棄上清液，加入2 ml凍存液，按照4℃ 0.5 h、-20℃ 1 h，-80℃過夜保存的順序依次凍存，最終保存在液氮罐中[10]。

將凍存管放入37℃水浴箱中快速搖動，盡量在90 s內使細胞解凍，加入到2 ml無菌離心管中，以800 r/min的速度離心10 min，吸干上清液，加入1 ml新鮮細胞培養液使細胞懸浮，轉移至T25細胞瓶中培養，再加入4 ml新鮮培養基，24 h后更換培養液去除漂浮的死亡細胞。

1.4 MDCK細胞嘌呤霉素篩選

選擇生長狀態良好的F3代細胞，以1×104/孔的細胞密度接種在24孔細胞培養板中。待細胞長至50%～60%時，棄去培養液，PBS溶液清洗3次，加入含有不同篩選濃度的培養基（含有嘌呤霉素和10%新生牛血清的DMEM培養液）[11]，培養液中嘌呤霉素濃度為1～10 μg/ml。1 μg/ml為1個梯度，用培養液配置成不同的篩選濃度，每個濃度值設置3個重復孔、3個對照孔[12]。每2 d更換1次篩選培養基，在顯微鏡下觀察并記錄細胞生長狀況，第4～7 d細胞全部死亡的最低濃度即為最小嘌呤霉素篩選濃度。

1.5 MDCK細胞感染SV40-LT病毒液

將復蘇后的F3代MDCK細胞按照1×104/孔的細胞密度接種于24孔細胞培養板中，細胞匯合度為50%時，進行病毒感染。按照吉凱基因公司說明書以及MDCK細胞的moi值進行操作。設定moi值為100，根據細胞的moi數值和病毒滴度，加入SV40-LT病毒液，16 h后更換完全培養基，繼續培養24 h后將細胞轉移至細胞瓶中培養[13]。

1.6 陽性細胞篩選

感染SV40-LT病毒液的細胞加入4 μg/ml的嘌呤霉素篩選培養基，未感染的MDCK細胞也加入相同濃度作為對照[14]。每2 d更換1次篩選培養液，出現大量漂浮以及死亡細胞時，變為每日更換。4～7 d未感染的MDCK細胞死亡后，剩余感染SV40-LT病毒液的細胞即為陽性細胞。在篩選過程中首次長滿T25細胞瓶時命名為F1代。感染SV40-LT基因篩選獲得的細胞系命名為MDCK-SV40。

1.7 MDCK-SV40細胞中SV40-LT基因檢測

將MDCK-SV40細胞F3代的總RNA進行抽提，按照RNA反轉錄試劑盒說明書進行操作，對抽提后檢測合格的cDNA進行qPCR檢測SV40-LT基因表達情況[15]。相應引物序列見表1。采用Real-time-qPCR檢測SV40-LT的表達。引物序列應用Primer Primer 5.0軟件設計，由北京擎科生物科技有限公司合成，內參為ACTB（肌動蛋白）。

表1 qPCR引物

1.8 細胞免疫熒光鑒定MDCK-SV40中的SV40-LT基因表達

將未感染的F3代MDCK細胞、F3代MDCK-SV40細胞分別以1×104個/孔接種于12孔板中，培養2 d進行免疫熒光試驗。細胞長至70%時，PBST洗滌3次[16]。4%多聚甲醛固定爬片15 min。PBST洗滌3次，加入0.1%TritonX-100室溫通透20 min。PBST洗滌3次，滴加山羊血清，37℃封閉30 min。棄去封閉液，滴加一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜。PBST洗滌3次，加熒光二抗，37℃孵育2 h。PBST洗滌3次，滴加DAPI避光孵育5 min，吸干爬片上的液體，將爬片放置在滴有適量抗熒光淬滅劑的載玻片上，激光共聚焦拍攝。

2 結果

2.1 MDCK細胞傳代培養的形態

觀察細胞狀態，消化后的細胞團塊貼壁后進行生長，并逐漸鋪滿瓶底，呈鋪路石狀單層排布，在對數生長期呈火焰狀生長，是典型的上皮樣細胞（圖1）。

圖1 F3代MDCK細胞（×40）

2.2 細胞凍存與復蘇

取3支凍存的MDCK細胞進行細胞活率測定，并計算其平均值，MDCK細胞凍存前平均活力為96.75%，凍存1個月后復蘇，測得平均活力為93.28%，細胞活率有所下降，但對后續試驗無實質性影響。

2.3 MDCK細胞嘌呤霉素篩選

F3代MDCK細胞經篩選培養后，第7 d細胞死亡的最低濃度為4 μg/ml（圖2）。

圖2 F3代MDCK細胞嘌呤霉素篩選（×40）

2.4 MDCK細胞感染SV40-LT病毒液及陽性細胞篩選

由圖3可知，感染的細胞在經過72 h后于熒光顯微鏡下觀察，感染率為50%～60%。篩選獲得的MDCK-SV40細胞系已傳至F15代。細胞均呈鋪路石狀排列，并單層生長，生長速度較快，按1∶3傳代后2 d就可長滿瓶底，未出現生長緩慢或漂浮死亡細胞，且未出現細胞衰老現象。

圖3 MDCK-SV40細胞感染及陽性細胞篩選

2.5 MDCK-SV40細胞中SV40-LT基因檢測情況

本試驗通過qPCR法分析了F3代MDCKSV40細胞的表達情況，利用未感染F3代MDCK細胞作對照，結果顯示MDCK-SV40相較于MDCK細胞中SV40-LT的基因表達差異顯著（P＞0.05，圖4），表明SV40-LT基因在MDCK細胞中經慢病毒感染后成功表達，且傳代后表達穩定。

圖4 MDCK-SV40中SV40-LT的表達情況

2.6 MDCK-SV40細胞中SV40-LT的基因表達情況

通過免疫熒光染色法鑒定SV40-LT在MDCK-SV40細胞蛋白中的表達。結果表明，在F15代中，SV40-LT主要表達于MDCK-SV40細胞的胞質和細胞核周圍，SV40-LT在MDCK和MDCK-SV40細胞核中的表達強弱不同。未感染的MDCK細胞表達為陰性，表明SV40-LT基因成功轉入MDCK-SV40細胞中，并通過細胞轉錄翻譯后穩定表達。

圖5 細胞免疫熒光鑒定MDCK-SV40細胞中SV40-LT的表達（×40）

3 結語

季節性流感越發頻繁，為適用于相同數量的預備疫苗，需要更快、產量更高的細胞以應對目前困境。流感病毒的生長環境依賴于合適的表面受體，在MDCK細胞中病毒復制優于其他受體。與雞胚培養相比，MDCK細胞的病毒產量較高且具有更快的生產過程，是疫苗生產的優選宿主。

端粒酶是一種永生基因，其復合物可保持端粒長度，這是細胞增殖所必需的。p53是一種促進細胞周期阻滯、DNA修復、細胞衰老凋亡的轉錄因子，也是一種高度保守的抑癌基因。抑制p53通路即可誘導細胞無限增殖。SV40-LT可直接作用于p53使細胞永生化。

穩定的轉染系統需借助病毒載體來敲低或過表達基因，嘌呤霉素可用于選擇在這些系統中表達pac基因的感染細胞。本試驗中通過不同梯度地篩選，確定MDCK的最小嘌呤霉素濃度為4 μg/ml，后續的陽性細胞篩選中也通過對照確定了經篩選后的細胞團。未挑取單克隆細胞，是考慮到細胞感染后狀態較差，且單個細胞難以在短時間內大量增殖，從而影響后續鑒定。

MDCK細胞接種后1～6 h開始貼壁生長，細胞倍增時間約為30 h。相較之下，MDCK-SV40倍增時間明顯縮短，生長速率加快，貼壁能力增強，表明SV40-LT對細胞有顯著的增殖作用，且篩選后的F15代細胞仍呈鋪路石狀對數生長，增殖速度穩定，未出現生長緩慢或大量漂浮死亡的現象，現已傳30多代。這些結果表明MDCK-SV40細胞系已成功構建。

本研究在MDCK-SV40細胞建系過程中，只采用了SV40-LT基因導入的方法，選擇了2個形態、生長良好的克隆株進行連續傳代培養，表明SV40-LT單基因導入MDCK細胞的方法是可行的。試驗通過MDCK細胞感染SV40-LT基因，提高了細胞生長速度，為永生化細胞建系研究提供了技術依據。