中老年骨關(guān)節(jié)炎患者腫瘤壞死因子-α、鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性*

劉小莉，鄒 明，張 靜，張紅梅

四川省骨科醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都 610041

骨關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)表面軟骨遭到破壞，而周?chē)切越M織增生為病理特征的關(guān)節(jié)病，可導(dǎo)致受累關(guān)節(jié)產(chǎn)生疼痛，活動(dòng)時(shí)加重，久不活動(dòng)時(shí)有僵硬感[1]。骨關(guān)節(jié)炎在年齡超過(guò)50歲的人群中發(fā)病率較高，嚴(yán)重影響中老年人的身體健康及生活質(zhì)量。骨關(guān)節(jié)炎病變部位分泌物的檢測(cè)對(duì)反映關(guān)節(jié)代謝狀態(tài)有重要作用，檢測(cè)其中特異性分子將有助于判斷該病的病理變化，對(duì)臨床早期診斷具有重要意義[2]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種促炎性細(xì)胞因子，參與免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)等，在重癥類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血液中可發(fā)現(xiàn)TNF-α升高[3]。鈣網(wǎng)織蛋白(CRT)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要鈣結(jié)合蛋白，參與機(jī)體多種生理、病理過(guò)程。研究報(bào)道，CRT與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑膜炎性反應(yīng)和血管形成有關(guān)[4]。目前，對(duì)于中老年骨關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)TNF-α、CRT水平的相關(guān)研究較少。本研究以95例中老年骨關(guān)節(jié)炎患者為研究對(duì)象，探討中老年骨關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)TNF-α、CRT表達(dá)情況，并分析二者水平與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系，為中老年骨關(guān)節(jié)炎的臨床診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2020年2月本院收治的95例中老年骨關(guān)節(jié)炎患者納入病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，X線片等影像學(xué)檢查結(jié)果顯示滑膜、骨贅增生，半月板、側(cè)副韌帶磨損及膝關(guān)節(jié)內(nèi)外翻畸形；(2)年齡55～80歲；(3)對(duì)本研究?jī)?nèi)容知情，并簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并急性或慢性感染性疾病、出血性疾病；(2)合并嚴(yán)重骨質(zhì)疏松、骨纖維異常或骨性融合；(3)合并心、肝、腎、肺功能障礙。病例組包括男55例，女40例；年齡55～80歲，平均(65.12±2.07)歲；病程1～5年，平均(3.46±1.03)年；單膝患病83例，雙膝患病12例；病理類(lèi)型包括軟骨型12例，滑膜型18例，游離體型7例，半月板型15例，混合型43例。根據(jù)Michel Lequesen膝骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重度分級(jí)指數(shù)(ISOA)[6]將95例中老年骨關(guān)節(jié)炎患者分為中度組30例，重度組46例，極重度組19例。另外選取同期因交叉韌帶斷裂行手術(shù)治療的患者60例為對(duì)照組，留取其滑膜液和手術(shù)切除的正常滑膜組織，其中：男29例，女31例；年齡56～80歲，平均(64.52±4.67)歲。病例組和對(duì)照組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2方法

1.2.1獲取關(guān)節(jié)滑膜組織和滑膜液 在關(guān)節(jié)鏡檢查或行膝關(guān)節(jié)腔穿刺、沖洗術(shù)及其他相應(yīng)手術(shù)時(shí)，注入1.0 mL的生理鹽水，反復(fù)回抽、注入3遍，將最后一次抽出的液體注入生化管中，以3 000 r/min離心5 min，于20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ￡P(guān)節(jié)滑膜組織，大小2 cm×2 cm，甲醛固定，室溫保存。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)TNF-α、CRT水平 采用ELISA法檢測(cè)滑膜液中TNF-α、CRT水平，ELISA法檢測(cè)試劑盒由默沙克生物科技有限公司提供。

1.2.3吸光度值(A值)檢測(cè) 吸取100 μL關(guān)節(jié)滑膜液、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，36%孵箱避光孵育90 min，加入生物素化抗體，孵育60 min，加入酶結(jié)合物，再次孵育30 min，加入顯色底物孵育15 min，加入終止液，于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4免疫組化法檢測(cè)滑膜組織中TNF-α、CRT表達(dá)情況 取滑膜組織標(biāo)本，浸臘包埋后，依次進(jìn)行切片、烤片、脫蠟水化、封閉內(nèi)源性酶；BSA溶液孵育1 h，加入兔抗人TNF-α抗體及CRT抗體，孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞，并進(jìn)行脫水、透明、封片，觀察結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞呈棕褐色，陰性表達(dá)呈淡黃色或淺棕色。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同嚴(yán)重程度骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平比較 中度組、重度組、極重度組骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；重度組、極重度組骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平明顯高于中度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，極重度組骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平明顯高于重度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同嚴(yán)重程度骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平比較

2.2滑膜組織中TNF-α、CRT的表達(dá)情況 正常滑膜組織中未見(jiàn)TNF-α表達(dá)(圖1A)，TNF-α在中老年骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)位于滑膜襯里層，且有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B)；CRT在正常滑膜組織中呈陰性表達(dá)(圖1C)，在中老年骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)主要位于血管周?chē)突ひr里層，表達(dá)量較低(圖1D)。

2.3各組滑膜組織中TNF-α、CRT的A值比較 中度組、重度組、極重度組骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中TNF-α、CRT的A值明顯大于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；重度組、極重度組骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中TNF-α、CRT的A值明顯大于中度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，極重度組骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中TNF-α、CRT的A值明顯大于重度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組滑膜組織中TNF-α、CRT的A值比較

注：A為正常滑膜組織中TNF-α表達(dá)情況；B為中老年骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中TNF-α表達(dá)情況；C為正常滑膜組織中CRT表達(dá)情況；D為中老年骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中CRT表達(dá)情況。

2.4滑膜液TNF-α、CRT水平與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 TNF-α、CRT水平與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.667，P<0.001；r=0.704，P<0.001)。

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性關(guān)節(jié)病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)變形及關(guān)節(jié)活動(dòng)受限等。中老年人是骨關(guān)節(jié)炎高發(fā)群體，75歲以上人群中發(fā)病率高達(dá)80%，60歲以上人群中發(fā)病率為50%[7]。該病的發(fā)生與肥胖、衰老、炎性反應(yīng)及創(chuàng)傷等多種因素有關(guān)。人體關(guān)節(jié)表面有一層光滑組織，主要保證關(guān)節(jié)活動(dòng)順暢性，而老年人許多組織器官開(kāi)始衰老，關(guān)節(jié)軟骨磨損變薄，關(guān)節(jié)邊緣形成骨刺，進(jìn)而引發(fā)骨關(guān)節(jié)退行性病變[8-9]。隨著分子生物學(xué)不斷發(fā)展，血清中分子標(biāo)志物的檢測(cè)成為臨床判斷各種疾病進(jìn)展的重要輔助手段。

TNF-α作為常見(jiàn)促炎性細(xì)胞因子，參與局部炎性反應(yīng)，具有殺傷靶細(xì)胞、促細(xì)胞凋亡及內(nèi)皮細(xì)胞活化作用，參與許多關(guān)節(jié)疾病，如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等。楊榮等[10]發(fā)現(xiàn)，膝關(guān)節(jié)炎患者血清中TNF-α水平明顯上升，并隨著關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的增加呈不斷升高趨勢(shì)。趙娜等[11]的研究顯示，創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清中TNF-α水平[(41.40±14.63)ng/L]明顯高于健康對(duì)照者[(24.53±10.37)ng/L]。TNF-α在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中最關(guān)鍵的作用是上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)發(fā)生，還可刺激軟骨細(xì)胞合成白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8等，進(jìn)一步增加炎性反應(yīng)[12]。本研究結(jié)果顯示：對(duì)照組TNF-α水平明顯低于中度組、重度組和極重度組骨關(guān)節(jié)炎患者，重度組、極重度組骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜液中TNF-α水平明顯高于中度組，極重度組骨關(guān)節(jié)炎患者明顯高于重度組，即TNF-α表現(xiàn)為隨病情加重逐漸上升趨勢(shì)；TNF-α在正常滑膜組織中呈陰性表達(dá)，在骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，A值的變化趨勢(shì)與其在滑膜液中的變化情況一致。經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，TNF-α水平與中老年骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.667，P<0.001)，說(shuō)明TNF-α能夠促進(jìn)中老年骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展，加重病情，這主要與TNF-α對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的破壞有關(guān)，其通過(guò)刺激軟骨降解酶及介導(dǎo)前列腺素合成分泌，破壞軟骨組織，促進(jìn)骨吸收。CRT是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白，普遍存在于生物細(xì)胞中，在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞表面及細(xì)胞外基質(zhì)中均有表達(dá)。研究報(bào)道，CRT參與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程，與患者關(guān)節(jié)滑膜炎性反應(yīng)有緊密聯(lián)系[13]。滑膜血管翳的形成是關(guān)節(jié)炎的重要病理表現(xiàn)，新生血管向滑膜液輸送炎癥細(xì)胞，同時(shí)為滑膜異常增生提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使滑膜長(zhǎng)期處于炎性反應(yīng)狀態(tài)，增加血管翳的侵襲性[14]。CRT可通過(guò)多種途徑參與血管翳的形成，其中關(guān)節(jié)炎的共享表位是其主要作用途徑，通過(guò)該途徑參與固有免疫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終促使血管翳形成[15]。丁紅梅等[16]研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)CRT水平較穩(wěn)定期高，同時(shí)與IL-6、TNF-α等炎癥因子水平呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)：CRT在病例組各亞組患者滑膜液及滑膜組織中的水平均高于對(duì)照組，同時(shí)隨著疾病嚴(yán)重程度呈不斷上升趨勢(shì)，提示該指標(biāo)與骨關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)程有一定關(guān)系。相關(guān)分析顯示，CRT水平與骨關(guān)節(jié)炎疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.704，P<0.001)，提示CRT會(huì)加重老年骨關(guān)節(jié)炎病情。本研究還發(fā)現(xiàn)：TNF-α在中老年骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的表達(dá)位于滑膜襯里層，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；CRT表達(dá)主要位于血管周?chē)突ひr里層，表達(dá)量較低。

綜上所述，中老年骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜液中TNF-α、CRT水平升高，并隨著病情加重呈上升趨勢(shì)，二者水平與該病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。TNF-α、CRT有望成為臨床診斷中老年骨關(guān)節(jié)炎的潛在血清學(xué)指標(biāo)。