血漿Nesfatin-1、DKK-1水平與股骨頭壞死的關系

龐士龍， 王 漢， 張志強， 李 強， 朱如森

（1.天津市寧河區醫院骨科，天津 301500；2.天津市人民醫院脊柱外科，天津 300121）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是由多種因素引起股骨頭慢性血供不足、骨細胞凋亡而引發的疾病，可導致股骨頭結構改變和髖關節功能障礙。多數 ONFH患者在確診后的數年內可能發展為股骨頭塌陷和嚴重髖關節骨關節炎，需要手術治療[1]。ONFH發病機制尚不清楚。有研究結果顯示，脂肪因子通過與骨細胞表面受體結合參與骨代謝調節過程[2]。攝食抑制因子1（Nesfatin-1）是一種新型脂肪因子，對攝食活動、糖脂代謝具有調節作用[3]。骨結構重建失衡、骨細胞凋亡是ONFH主要的病理改變環節，Wnt信號通路參與成骨細胞/破骨細胞系統調節和骨重建過程，與ONFH發病有關[4]。Dickkopf-1（DKK-1）是內源性Wnt信號通路拮抗劑，可抑制成骨細胞分化，促使破骨細胞生成，導致骨量流失，介導各類骨骼疾病的發生[5]。目前，Nesfatin-1、DKK-1在ONFH發病機制中的作用尚不清楚。本研究擬探討血漿Nesfatin-1、DKK-1水平與ONFH病情嚴重程度和股骨頭塌陷的關系，以期為臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年5月—2020年1月天津市寧河區醫院骨科收治的ONFH患者85例（ONFH組），其中男36例、女49例，年齡24～37歲，病程10～42個月。病因包括激素性（39例）、酒精性（21例）、創傷性（15例）、特發性（10例）。國際骨循環學會（the Association Research Circulation Osseous，ARCO）分期[6]Ⅱ期（21例）、Ⅲ期（36例）、Ⅳ期（28例）。85例ONFH患者中股骨頭塌陷[X線片或電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）提示股骨頭表面骨質缺損，呈凹陷狀]50例。納入標準：（1）存在典型臨床癥狀或髖關節疼痛、活動受限，經X線片、CT、MRI或放射性核素顯像檢查確診，符合《成人股骨頭壞死臨床診療指南》標準[7]；（2）年齡＞18周歲；（3）未進行骨科手術治療。排除標準：（1）合并骨折、骨腫瘤、風濕性關節炎、類風濕性關節炎、骨質疏松、脊椎或大關節病等其他骨科疾病；（2）肥胖、代謝綜合征、系統性硬化癥患者；（3）合并高血壓、糖尿病、高脂血癥等疾病。另選取同期天津市寧河區醫院體檢中心體檢健康者50名作為正常對照組，其中男21名、女29名，年齡26～39歲；均排除糖尿病、高血壓、冠心病、高脂血癥等疾病的患者以及近期服用影響骨代謝藥物者。2個組年齡、性別差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究經天津市寧河區醫院倫理委員會批準，所有對象均知情同意，簽署知情同意書。

1.2 方法

采集所有患者入院24 h內、正常對照者體檢當日的空腹靜脈血3～5 mL，乙二胺四乙酸二鈉抗凝，4 ℃ 1 000×g離心10 min，分離血漿，-80 ℃保存，統一檢測。采用酶聯免疫吸附試驗檢測血漿Nesfatin-1、DKK-1水平，Nesfatin-1試劑盒（最低檢測限0.15 ng/L，線性范圍10～110 ng/L，批間和批內變異系數≤10%，標準曲線r值為0.993～0.999）購自上海藍基生物科技有限公司，DKK-1試劑盒（最低檢測限0.13 pg/mL，線性范圍10～120 pg/mL，批間和批內變異系數≤10%，標準曲線r值為0.989～0.999）購自北京榮志海達生物科技有限公司。檢測儀器為BIOBASE2000全自動酶免分析儀（山東博科公司）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件和Med Calc 19.0軟件進行統計分析。采用Kolmogorov-Smirnov對計量資料進行擬合優度檢驗。呈正態分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman秩相關分析評估Nesfatin-1、DKK-1與ARCO分期之間的相關性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估各項指標診斷股骨頭塌陷的效能，曲線下面積（area under curve，AUC）比較采用Z檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ONFH組與正常對照組血漿Nesfatin-1、DKK-1水平比較

ONFH組血漿Nesfatin-1、DKK-1水平高于正常對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 ONFH組與正常對照組血漿Nesfatin-1、DKK-1水平比較 ±s

表1 ONFH組與正常對照組血漿Nesfatin-1、DKK-1水平比較 ±s

注：空白表示無此項。

組別 例數 Nesfatin-1/（ng/L） DKK-1/（pg/mL）ONFH組 85 61.24±13.71 72.14±15.26正常對照組 50 35.12±6.35 43.26±7.46 t值 12.681 12.517 P值 0.000 0.000

2.2 血漿Nesfatin-1、DKK-1與ONFH患者臨床特征的關系

ONFH患者血漿Nesfatin-1、DKK-1水平隨著ARCO分期的增高而升高（P＜0.05）。股骨頭塌陷的ONFH患者血漿Nesfatin-1、DKK-1水平高于股骨頭未塌陷的ONFH患者（P＜0.05）。不同年齡、性別及病因的ONFH患者之間血漿Nesfatin-1、DKK-1水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床參數的ONFH患者之間血漿Nesfatin-1、DKK-1水平比較 ±s

表2 不同臨床參數的ONFH患者之間血漿Nesfatin-1、DKK-1水平比較 ±s

注：與Ⅱ期比較，*P＜0.05；與Ⅲ期比較，#P＜0.05；空白表示無此項。

臨床參數 例數 Nesfatin-1/（ng/L） DKK-1/（pg/mL）性別男性 36 61.19±13.42 72.09±15.06女性 49 61.27±14.36 72.18±15.33 t值 0.026 0.027 P值 0.979 0.979年齡≥35歲 42 61.42±13.95 72.81±15.43＜35歲 43 61.03±13.01 71.49±14.58 t值 0.133 0.405 P值 0.894 0.686病因激素性 39 61.21±13.12 72.21±15.29酒精性 21 61.12±13.23 72.29±15.44創傷性 15 61.14±13.11 72.30±15.23特發性 10 61.76±13.52 71.31±15.27 F值 0.682 0.351 P值 0.532 0.823 ARCO分期Ⅱ期 21 50.63±10.42 64.20±12.14Ⅲ期 36 62.35±13.02* 71.24±14.15*Ⅳ期 28 67.77±15.24*# 79.25±18.62*#F值 13.264 15.243 P值 0.000 0.000股骨頭塌陷是 50 66.24±16.32 76.15±16.35否 35 54.10±11.53 66.41±14.23 t值 3.836 2.848 P值 0.000 0.006

2.3 血漿Nesfatin-1、DKK-1水平與ARCO分期的相關性

Spearman秩相關分析結果顯示，血漿Nesfatin-1、DKK-1水平與ARCO分期呈正相關（rs值分別為0.733、0.626，P=0.000）。

2.4 血漿Nesfatin-1、DKK-1單項檢測及聯合檢測診斷股骨頭塌陷的效能

ROC曲線分析結果顯示，血漿Nesfatin-1、DKK-1單項檢測及聯合檢測（以Nesfatin-1、DKK-1任意1項陽性為陽性）診斷股骨頭塌陷的AUC分別為0.707、0.643、0.889。血漿Nesfatin-1、DKK-1聯合檢測的AUC高于單項檢測（Z值分別為2.352、2.964，P＜0.05）。見表3。

表3 血漿Nesfatin-1、DKK-1、單項及聯合檢測診斷股骨頭塌陷的ROC曲線參數

圖2 血漿Nesfatin-1、DKK-1單項檢測及聯合檢測診斷股骨頭塌陷的ROC曲線

3 討論

ONFH是臨床常見的致殘性疾病。ONFH患者對缺血骨組織修復能力差，容易發生股骨頭塌陷變性和骨折，是引起中青年人殘疾的主要因素之一。ONFH的發病機制尚不明確，目前發現的病因包括血管內血栓形成、脂肪代謝異常、髓內脂肪細胞肥大、骨質疏松[8]。股骨頭塌陷是ONFH疾病進展的中晚期階段，發生于股骨頭壞死修復期，屬于不可逆損傷，臨床表現為突發的疼痛加重，X線片可見“新月征”，MRI提示骨髓水腫和關節積液。股骨頭塌陷可造成嚴重的髖關節病變，往往需要接受人工髖關節置換手術[9]。有效預測股骨頭塌陷對指導臨床治療十分重要，目前預測股骨頭塌陷的方法為定期X線或MRI檢查，但X線輻射性大，出現“新月征”時可能已發生軟骨下骨折；MRI費用高，禁忌癥多。生物學標志物檢測方便，可重復檢測，因此探討與ONFH發病和進展密切相關的分子機制具有重要意義。

Nesfatin-1是一種由82個氨基酸組成的新飽食分子，來源于核組蛋白2，表達于胃腸道系統、生殖系統、下丘腦神經元、腦干等組織，具有調節攝食、血糖、精神情緒作用，并具有抗炎和抗細胞凋亡的功能[10]。既往研究結果顯示，Nesfatin-1與消化、內分泌、神經等多種系統的疾病發生有關[11]。KVLIVIDZE等[12]的研究結果顯示，類風濕關節炎患者Nesfatin-1水平明顯升高，且與病情嚴重程度呈正相關，Nesfatin-1 在類風濕關節炎的發病機制中可能發揮促炎作用。動物實驗結果顯示，Nesfatin-1可上調雌激素缺乏相關骨質疏松大鼠骨鈣素、骨堿性磷酸酶水平，預防骨質疏松，提示Nesfatin-1對骨代謝有一定的調節作用[13]。本研究結果顯示，ONFH患者血漿Nesfatin-1水平明顯高于正常對照組（P＜0.05），且與ARCO分期呈正相關（rs=0.733，P＜0.05），說明Nesfatin-1可能參與了ONFH的發生，并與軟骨破壞程度有關。本研究結果還顯示，股骨頭塌陷的ONFH患者血漿Nesfatin-1水平高于股骨頭無塌陷的ONFH患者（P＜0.05），說明Nesfatin-1水平與ONFH患者股骨頭塌陷有一定關系。ZHANG等[14]發現血漿、關節液Nesfatin-1水平與膝關節炎患者的軟骨退變程度顯著相關。Nesfatin-1參與ONFH患者股骨頭塌陷的機制可能與其參與ONFH關節內滑膜炎癥反應有關，Nesfatin-1水平升高可能會刺激白細胞介素18、C反應蛋白等炎癥因子的釋放，加劇了關節內局部炎癥反應[15]，從而加重ONFH患者股骨頭的損壞程度，出現股骨頭塌陷。另外，Nesfatin-1可能通過調節骨代謝，抑制骨細胞生成，導致骨細胞凋亡和壞死，進而加重股骨頭的病變[11，13]。

DKK-1是一種分泌型糖蛋白，由成熟成骨細胞和骨細胞分泌，DKK-1通過與受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6結合阻斷Wnt/β-catenin信號在細胞內傳遞，具有調節細胞增殖、分化、遷移以及胚胎發育、器官發生和體內平衡等多種生物學功能[16]。DKK-1表達與惡性腫瘤發生、侵襲、轉移有關[17]。DKK-1還參與了骨代謝和骨重建的過程，參與系統性硬化癥和類風濕性關節炎[18]、脊椎關節病[19]等疾病的發病過程。關于DKK-1在ONFH中作用的研究較少，DKK-1是否參與了ONFH發病尚不清楚。本研究結果顯示，ONFH患者血漿DKK-1水平明顯高于正常對照組（P＜0.05），且隨著ARCO分期的增高而升高，說明DKK-1可能與ONFH有一定關系。本研究結果還顯示，股骨頭塌陷的ONFH患者血漿DKK-1水平高于股骨頭無塌陷的ONFH患者（P＜0.05），提示DKK-1水平升高與股骨頭塌陷有關。KO等[20]發現血清DKK1水平與ONFH的嚴重程度相關，敲除DKK1可減少地塞米松誘導的間充質細胞凋亡。DKK-1是Wnt/β-catenin通路的關鍵調控因子，可通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路破壞成骨-破骨系統穩定性，使成骨細胞生成減少，破骨細胞生成增多，導致骨吸收，加速骨細胞凋亡和壞死進程，進而導致股骨頭塌陷。抑制DKK-1表達可激活Wnt/β-catenin信號通路，增加成骨蛋白Runt相關基因2表達，促使骨髓間充質干細胞分化[21]。

本研究R O C曲線分析結果顯示，Nesfatin-1、DKK-1對ONFH患者股骨頭塌陷的診斷均有一定的價值，但敏感性均較低，而二者聯合檢測的效能相對較高。

綜上所述，血漿Nesfatin-1、DKK-1水平與ONFH患者股骨頭壞死程度有一定關系，但Nesfatin-1、DKK-1參與ONFH患者股骨頭塌陷的具體機制尚不清楚，需深入研究。