熒光染色法在真菌檢測中的應用

趙 琳， 喬 昀

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科，上海 200021）

目前已發現的對人類有致病性的真菌約有300多個種類。根據侵犯人體部位的不同，臨床上將致病真菌分為淺部真菌和深部真菌[1]。淺部真菌（癬菌）僅侵犯皮膚、毛發和指（趾）甲，而深部真菌能侵犯人體皮膚、黏膜、深部組織和內臟，甚至引起全身播散性感染。目前真菌的常用檢測方法包括直接涂片、革蘭染色、墨汁染色、真菌培養和KOH濕片法[2]。培養方法耗時長；直接涂片檢出率相對較低；KOH濕片法對檢驗人員的技術水平要求較高，容易漏檢[3]。近年來，熒光染色法在真菌感染診斷中的應用越來越廣。本研究采用熒光染色、直接涂片、革蘭染色、墨汁染色、真菌培養及KOH濕片法對臨床樣本進行同步檢測，以評估熒光染色法在真菌檢測中的價值。

1 材料和方法

1.1 樣本

收集2019年上海中醫藥大學附屬曙光醫院門診及住院患者臨床樣本232份，樣本類型包括痰（75份）、咽拭子（48份）、白帶（30份）、皮屑（15份）、甲屑（12份）、尿液（12份）、糞便（10份）、腦脊液（30份）。所有臨床樣本采集后均放置于無菌容器內送檢。痰、咽拭子、白帶、尿液及糞便等深部樣本同時采用熒光染色、直接涂片和革蘭染色進行檢測[4]，皮屑和甲屑淺表樣本同時采用熒光染色、KOH濕片法及真菌培養進行檢測[5]，腦脊液樣本采用熒光染色和墨汁染色進行檢測。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 （1）痰樣本取自患者第一口晨痰，置于無菌痰盒中。（2）咽拭子樣本采用無菌咽拭子采集管，用棉棒自患者咽喉部取樣。（3）白帶樣本采用無菌棉簽管，用棉棒自患者陰道內部取樣。（4）皮屑樣本，用75%乙醇消毒患者皮損部位，使用鈍頭刀片刮取皮屑。（5）甲屑樣本，用75%乙醇消毒患者病甲后，用消毒刀片刮取甲下碎屑。（6）尿液樣本取自患者第1次晨尿，使用無菌管收集保存，離心后取沉渣鏡檢。（7）糞便樣本取樣后置于無菌容器內。（8）腦脊液樣本離心后取沉淀物鏡檢。

1.2.2 熒光染色 采用南京漢瑞生物科技有限公司真菌熒光染色液進行染色。將樣本均勻涂于載玻片上，加1滴熒光染液，覆上蓋玻片，輕壓蓋玻片靜待1 min，待染液與樣本充分混勻后，在熒光顯微鏡下觀察，查見熒光標記的孢子或菌絲即為陽性。陽性對照白念珠菌（ATCC 14053）購自上海市臨床檢驗中心。

1.2.3 革蘭染色 采用珠海貝索生物技術有限公司革蘭染色液進行染色。將樣本均勻涂于載玻片上，在火焰上快速通過3次固定，加龍膽紫液染色1 min，流水沖洗；加媒染液染色1 min，流水沖洗；加脫色乙醇至無紫色脫落為止，流水沖洗；復染劑（石炭酸復紅）染色30 s，流水沖洗。干燥后，用高倍鏡查找真菌孢子和菌絲。陽性對照為白念珠菌（ATCC 14053）。

1.2.4 直接涂片 將樣本放置于載玻片上，加1滴0.9%氯化鈉溶液，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察，查見孢子或菌絲即為陽性。

1.2.5 KOH濕片法 將樣本放置于載玻片上，加1滴10% KOH溶液，蓋上蓋玻片，用酒精燈微加熱溶解甲屑，顯微鏡下查見孢子或菌絲即為陽性。

1.2.6 真菌培養 在超凈工作臺將皮屑、甲屑樣本接種于蛋白胨沙氏瓊脂培養基（上海科瑪嘉公司），置25 ℃溫箱中培養2周后觀察，有菌落生長為陽性，無菌生長則為陰性。

1.2.7 墨汁染色 樣本離心后，將沉淀物涂于潔凈玻片上，然后加1滴墨汁，蓋上蓋玻片鏡檢，背景呈黑褐色，菌體無色透明，有多糖莢膜。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計數資料以例或率表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同類型樣本形態學觀察結果

232份臨床樣本熒光染色結果顯示，可見菌絲及孢子發出明亮的藍色熒光，在暗黑的背景下，易于識別。痰樣本的熒光染色和直接涂片結果見圖1，曲霉菌的熒光染色結果見圖2。

圖1 痰樣本熒光染色和直接涂片結果

圖2 曲霉菌熒光染色結果

2.2 熒光染色、革蘭染色、直接涂片真菌陽性檢出率比較

熒光染色、革蘭染色、直接涂片對除腦脊液樣本外的175份深部樣本（痰、咽拭子、白帶、尿液、糞便）的真菌陽性檢出率分別為87.43%、78.86%、74.29%，熒光染色陽性檢出率高于革蘭染色、直接涂片（χ2值分別為4.857、9.765，P＜0.05）。見表1。

表1 熒光染色、革蘭染色、直接涂片真菌陽性檢出率比較 份/%

2.3 熒光染色和KOH濕片法、真菌培養真菌陽性檢出率比較

熒光染色和KOH濕片法、真菌培養對27份皮屑和甲屑淺表樣本的真菌陽性檢出率分別為85.19%、74.07%和62.96%，熒光染色陽性檢出率高于KOH濕片法、真菌培養（χ2值分別為4.523、5.684，P＜0.05）。見表2。

表2 熒光染色和KOH濕片法、真菌培養真菌陽性檢出率比較 份/%

2.4 熒光染色和墨汁染色的真菌陽性檢出率比較

熒光染色和墨汁染色對30例腦脊液樣本的真菌的陽性檢出率分別為10.00%和20.00%，差異無統計學意義（P=0.531）。

3 討論

目前，真菌感染常用的實驗室檢測方法有直接涂片、革蘭染色、真菌培養、KOH濕片法、墨汁染色、真菌培養以及聚合酶鏈反應。真菌培養由于時間較長，易延誤患者病情和治療；聚合酶鏈反應雖然有靈敏度高、特異性強、快速等優勢，但是對實驗環境和人員要求較高；革蘭染色操作繁瑣、耗時長，易受染液質量、檢驗人員水平等多種因素的影響，且不能對甲屑等樣本進行檢測；KOH濕片法因真菌孢子易與脂肪滴、紅白細胞混淆，不易區分，需要工作人員有一定的經驗，且操作較繁瑣，顯白色背景，不易區分孢子、菌絲的形態。熒光染色是根據染料中帶有熒光素的抗體能與真菌細胞壁中葡聚糖層和幾丁質層中的β-糖苷鍵特異性結合的特性，間接將熒光素標記到真菌細胞壁上，在熒光顯微鏡下可觀察到真菌輪廓，其利用的是抗體特異性結合和形態學觀察的原理，能有效降低背景干擾，孢子及菌絲能發出明亮的藍色熒光，在熒光顯微鏡下與黑色背景形成明顯反差，易于在鏡下尋找和識別。本研究對175份痰、咽拭子、白帶、尿液、糞便深部臨床樣本，采用熒光染色、直接涂片、革蘭染色進行檢測，陽性檢出率分別為87.43%、78.86%和74.29%，熒光染色的陽性檢出率顯著高于其他2種檢測方法（P＜0.05）；對27份皮屑和甲屑淺表樣本采用熒光染色與KOH濕片法、真菌培養進行檢測，真菌陽性檢出率分別為85.19%、59.26%和55.56%，熒光染色的陽性檢出率也高于其他2種檢測方法（P＜0.05）；對30份腦脊液樣本，熒光染色和墨汁染色的真菌陽性檢出率分別為10.00%和20.00%，差異無統計學意義（P=0.531）。提示熒光染色在真菌檢測方面，針對各種樣本均可進行檢測，同時能通過形態初步鑒定淺部真菌，是一種快速、有效的新方法[6]。熒光染色操作簡便，只需要在載有樣本的玻片上，加1滴熒光液即可在熒光顯微鏡下觀察，且熒光液對脂肪滴不產生標記，易與真菌孢子鑒別[7]。

綜上所述，熒光染色檢測真菌具有特異性高、靈敏度高、操作簡便的優勢，在真菌快速檢測中有很好的臨床應用價值。