干制對生鮮調理草魚肉貯藏品質和菌群結構的影響

田 麗 莊 帥 羅 濤 李鳴澤 洪 惠 譚雨青 羅永康

(中國農業大學 食品科學與營養工程學院，北京 100083)

草魚是我國重要的淡水魚養殖品種，2020年草魚養殖總產量為557.108 3萬t，占淡水魚養殖總產量的21.72%[1]。魚肉由于結締組織少，水分和蛋白質含量高，pH偏中性等原因適合微生物生長而腐敗變質。調理草魚肉是淡水加工產品中的一種，經過調理不僅可以改善魚肉的風味，而且可以延長魚肉的貨架期[2]。

魚肉的水分約占整體質量的75%～80%，包括結合水、不易流動水和自由水。水分含量高不僅使微生物活躍，同時其中的酶活性也高，易造成魚肉的腐敗變質。干制是指在受控條件下通過加熱和傳質的方式將鮮魚的水分含量降低到不利于細菌生長和繁殖的低水分含量水平，是一種傳統的魚類加工和保存方法，具有成本低，易操作的特點[3]。然而在目前魚肉干制的研究中，大多數將魚肉的水分含量降低至15%～40%，研究方向主要集中在比較不同干燥方式對魚肉品質的影響以及最適干燥工藝方面[4-6]。雖然這些研究中魚肉的水分含量和菌落總數降低了，但是過度的干燥也增大了魚肉的硬度和咀嚼性，降低彈性，促進蛋白質的降解和脂肪氧化，降低亮度，增強黃度，造成褐變等，使魚肉的品質變差[7-8]。

為了降低魚肉蛋白降解和脂肪氧化程度，保證其具有較好的質構、色澤和感官品質，需要控制魚肉的脫水程度，但是降低脫水程度是否能延長魚肉的貨架期還有待進一步研究。本研究擬以生鮮調理草魚肉為研究對象，通過降低魚肉的脫水程度，研究生鮮調理草魚肉在(4±1)℃貯藏過程中的品質變化，以期為延長生鮮調理草魚肉貯藏時間提供研究基礎。

1 試驗材料與設備

1.1 試驗材料

本試驗于2020年12月在中國農業大學食品科學與營養工程學院進行。鮮活草魚，購自北京市朝陽區喜龍生鮮超市，體長為(52.8±1.0)cm；體重(1 392±71)g；三磷酸腺苷(ATP)關聯物和生物胺標準品購自美國Sigma-Aldrich公司；丙酮、乙腈、甲醇購自Fisher Scientific公司；高氯酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鉀、氨水購自北京化學試劑公司；三氯乙酸、硼酸、氧化鎂，氯化鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；BCA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；無菌均質袋購自Interscience公司。

1.2 儀器設備

BCD-251 WBCY冰箱，青島海爾股份有限公司；FE-20 pH計，Mettler Toledo公司；DSHZ-300A水域恒溫振蕩器，蘇州培英實驗設備有限公司；T18分散劑，德國IKA 公司；GL-21M冷凍離心機，長沙平凡儀器表有限公司；LC-16高效液相色譜儀，江蘇蘇州島津儀器有限公司；P4紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；NR110手持色差儀，深圳Threenh科技有限公司。

2 試驗方法

2.1 樣品預處理

在聚乙烯塑料袋中裝入適量干凈的水，將18條草魚放入袋中，向袋中充滿氧氣并密封，然后將其運輸到實驗室。將活草魚迅速敲擊其頭部致死，刮鱗，去內臟，沖洗干凈后將每條魚片成4片，魚片長寬厚約10 cm×10 cm×2 cm，魚片用無菌水沖洗干凈，在不銹鋼網架上晾10 min后分別裝入聚乙烯保鮮袋中；將魚片質量10%的水和魚水總質量1.5%的無碘食鹽溶解于燒杯中，將鹽水分別加入保鮮袋中，將其置于4 ℃腌制12 h。

腌制結束后，將所有魚片隨機分成3組，每組24片。具體分組如下：對照組，鹽腌后不脫水；脫水6%組，鹽腌后干燥脫去魚片質量6%的水分；脫水12%組，鹽腌后干燥脫去魚片質量12%的水分。

2.2 魚肉干燥

對照組不干燥，脫水6%和12%組采用干燥箱分別對魚肉脫水6%和12%，干燥溫度50 ℃，風速1.5 m/s，風向與魚片平行，相對濕度50%～55%，由前期實驗得到的干燥曲線擬合得到不同組的干燥時間：脫水6%組44 min，脫水12%組87 min。干燥完成后將魚片裝于聚乙烯保鮮袋中，貯藏于4 ℃，分別于第1、3、5、7、9、11、13天隨機從每組取3片魚肉進行指標的測定，并于第1和13天提取3組魚肉中微生物的DNA以測定魚肉中微生物的組成。

2.3 菌落總數的測定

菌落總數的測定參照Zhuang等[9]的方法。在超凈工作臺中取5 g魚肉于無菌拍打袋，向袋中加入45 mL無菌生理鹽水，在拍打機中拍打1 min，將拍打液進行10倍梯度稀釋，選擇3個適當的稀釋梯度，涂布100 μL均質液在平板計數瓊脂上，將平板置于30 ℃培養箱中48～72 h后進行微生物計數，菌落總數表達單位為lg(CFU/g)。

2.4 菌群結構的測定

菌群結構的測定參照Liu等[10]的方法。經過提取得到的細菌DNA用干冰運送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，委托該公司采用第二代測序技術進行PCR擴增和產物純化以及細菌16S rRNA基因V3～V4區的測序。

2.5 揮發性鹽基氮TVB-N質量分數的測定

揮發性鹽基氮TVB-N的測定參照Li等[11]的方法。稱取攪碎的魚肉5 g于離心管中，加入50 mL 蒸餾水，均質2 min，搖床上振蕩30 min，4 000 r/min 離心5 min，吸取5 mL上清液與5 mL氧化鎂(10 g/L)混合，蒸餾5 min。錐形瓶中加入10 mL硼酸溶液(20 g/L)和100 μL甲基紅-次甲基藍指示劑(2 g/L)以吸收溜出物，用0.01 mol/L的鹽酸標準溶液滴定吸收液至藍紫色，蒸餾水為空白對照。

2.6 TCA-可溶性肽質量摩爾濃度的測定

TCA-可溶性肽質量摩爾濃度的測定參照Zhuang等[12]的方法。稱取1 g攪碎的魚肉于離心管中，加入9 mL 50 g/L的三氯乙酸溶液，均質1 min，碎冰中放置30 min，4 ℃、10 400 r/min離心5 min，取7～8 mL上清液儲存于-20 ℃冰箱。TCA-可溶性肽采用Lowry蛋白法進行測定，其質量摩爾濃度以每克肉中含的酪氨酸摩爾當量表示，μmol/g。

2.7 感官評價

感官評價參考Berizi等[13]的方法，并做少許調整。感官小組由訓練有素的9名實驗室成員組成，男女比為4:5，年齡為22～32歲，感官小組成員分別對魚肉的色澤、氣味、質地和總體可接受度進行5分制打分，評分標準見表1。

表1 生鮮調理草魚肉感官評價評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of fresh prepared grass carp flesh

2.8 ATP關聯物及K值的測定

ATP關聯物的提取和測定參照Li等[14]的方法。稱取1 g魚肉進行ATP關聯物的提取，提取液和ATP關聯物標準品用0.22 μm的超濾膜過濾后，在高效液相色譜上進樣測定，液相色譜條件：COSMOSIL 5C18-PAQ反相色譜柱(4.6×250 mm)，流動相A為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)，流動相B為甲醇，流速1 mL/min，進樣量50 μL，檢測波長為254 nm。通過將樣品中各峰的保留時間和峰面積與標準品對比進行ATP關聯物的定性和定量分析。

2.9 生物胺質量分數的測定

生物胺的提取及測定參照Zhuang等[9]的方法。稱取2 g攪碎的魚肉進行生物胺的提取，提取液及生物胺標準品衍生后，用0.22 μm的有機膜過濾，在高效液相色譜上進樣測定。液相色譜條件：COSMOSIL 5C18-PAQ反相色譜柱(4.6×250 mm)，流動相A為0.1 mol/L醋酸銨溶液，流動相B為乙腈，流速0.8 mL/min，進樣量50 μL，檢測波長為254 nm。通過將樣品中各峰的保留時間和峰面積與標準品對比進行生物胺的定性和定量分析。

2.10 數據統計與分析

所有試驗指標均測3個平行，試驗結果用平均值±標準差的形式表示，使用IBM公司統計軟件SPSS 17.0中的Duncan法對試驗數據進行差異顯著性分析，顯著水平為5%。

3 結果分析

3.1 感官評價

3組魚肉的感官評分均隨著貯藏時間的延長而降低(圖1)。在貯藏第9和11天，脫水12%組的色澤評分顯著高于對照和脫水6%組(P<0.05)，但貯藏第13天各組間無顯著差異。3組魚肉的氣味評分除第5天外均無顯著性差異。脫水6%和12%組在貯藏第1、11和13天質地評分顯著高于對照組(P<0.05)。從第9天開始，脫水6%和12%組的總體喜好度評分顯著高于對照組(P<0.05)。

標記點上黑色豎線表示平行數據間的標準偏差，圖2～4同。The black vertical line on each point represents the standard deviation between parallel data.Figs 2 to 4 are the same as Fig.1.圖1 不同脫水程度生鮮調理草魚肉4 ℃貯藏過程中色澤(a)、氣味(b)、質地(c)和總體可接受度(d)的變化Fig.1 Changes in color (a),odor (b),texture (c)attributes scores and overall acceptability scores (d) of fresh prepared grass carp fillets with different dehydration degrees during storage at 4 ℃

3.2 菌落總數

對照、脫水6%和12%組初始菌落總數分別為4.2、4.0和4.8 lg (CFU/g)(圖2)。隨著貯藏時間的延長，各組的菌落總數均增長，然而在第7、9和11天，各組間無顯著差異，說明在此期間脫水6%和12%組微生物生長比對照組慢。對照和脫水6%組的菌落總數在第7天，脫水12%組在9天超過7 lg (CFU/g)，說明脫水12%能夠有效控制生鮮調理草魚肉中微生物的生長。

圖2 不同脫水程度生鮮調理草魚肉4 ℃貯藏過程中菌落總數的變化Fig.2 Changes in total viable counts of fresh prepared grass carp fillets with different dehydration degrees during storage at 4 ℃

3.3 TVB-N的質量分數

對照、脫水6%和12%組初始TVB-N質量分數(w)分別為10.15、9.92和10.38 mg/100 g(圖3(a))。隨著貯藏時間的延長，各組的TVB-N質量分數均增長，在第5、7和9天，w(TVB-N)在脫水6%和12%組中均高于對照組，脫水12%組在第5和第9天具有顯著差異(P<0.05)，其他貯藏時間各組間無顯著差異。在貯藏第13天，對照、脫水6%和12%組的TVB-N質量分數分別增長至20.88、19.72和21.35 mg/100 g，脫水6%組最低。

3.4 TCA-可溶性肽的質量摩爾濃度

對照、脫水6%和12%組初始TCA-可溶性肽質量摩爾濃度(b)分別為1.88、2.04和2.38 μmol/g(圖3(b))。在貯藏前11 d，各組的b(TCA-可溶性肽)增長緩慢，之后各組均增長顯著(P<0.05)。第9天，脫水12%組顯著高于其他組(P<0.05)，而其他時間各組間無顯著差異。在貯藏第13天，對照、脫水6%和12%組的TCA-可溶性肽分別增長至4.13、3.86和4.62 μmol/g，脫水6%組最低。

圖3 不同脫水程度生鮮調理草魚肉4 ℃貯藏過程中TVB-N質量分數(a)和TCA可溶性肽質量摩爾濃度(b)的變化Fig.3 Changes in TVB-N mass fraction (a)and TCA-soluble peptides molality (b)of fresh prepared grass carp fillets with different dehydration degrees during storage at 4 ℃

3.5 ATP關聯物及K值

對照、脫水6%和12%組初始b(5′-肌苷酸IMP)分別為4.40、3.18和2.12 μmol/g(圖4)，各組的b(IMP)隨貯藏時間的延長而降低，第7和9天，對照和脫水6%組顯著高于脫水12%組(P<0.05)，而在第13天，脫水6%和12%組顯著高于對照組(P<0.05)。對照、脫水6%和12%組初始b(次黃嘌呤核苷HxR)分別為0.76、0.58和1.24 μmol/g，隨著貯藏時間的延長，對照組的b(HxR)先升高后降低，而脫水6%和12%組一直升高，并在貯藏第11和13天，脫水6%和12%組顯著高于對照組(P<0.05)。對照、脫水6%和12%組初始b(次黃嘌呤Hx)分別為0.04、0.39和0.79 μmol/g，初始K值分別為12.77%、21.55%和41.87%，隨著貯藏時間的延長，3組的b(Hx)和K值均逐漸增加。在貯藏前5 d，對照組K值顯著低于脫水6%和12%組(P<0.05)，而在貯藏第7、9和11天對照和脫水6%組無顯著差異。

圖4 不同脫水程度生鮮調理草魚肉4 ℃貯藏過程中IMP (a)、HxR (b)、Hx (c)質量摩爾濃度和K值(d)的變化Fig.4 Changes in IMP (a),HxR (b),Hx (c)molality and K-value (d)of fresh prepared grass carp fillets with different dehydration degrees during storage at 4 ℃

3.6 生物胺的質量分數

對照、脫水6%和12%組初始腐胺質量分數分別為1.73、1.38和1.36 mg/kg(表2)，3組的腐胺隨著貯藏時間的延長而增加，在貯藏第9、11和13天，脫水6%組腐胺質量分數顯著低于對照組(P<0.05)，在貯藏第11和13天，脫水6%和12%組無顯著差異(P<0.05)。對照、脫水6%和12%組初始尸胺質量分數分別為4.31、3.26和3.96 mg/kg，在貯藏過程中，各組的尸胺雖有波動，但整體仍然呈現升高的趨勢，在貯藏第11和13天，脫水6%組尸胺質量分數顯著低于另外2組(P<0.05)。

表2 不同脫水程度生鮮調理草魚肉4 ℃貯藏過程中生物胺的變化Table 2 Changes in biogenic amines of fresh prepared grass carp fillets with different dehydration degrees during storage at 4 ℃

3.7 菌群結構

高通量測序共檢測到248 533個有效序列，各組的覆蓋率均高于0.999，表明測序深度較高。Alpha多樣性分析發現隨著貯藏時間延長，Ace和Shannon指數減小(圖5(a)和5(b))，且在不同時間點脫水6%和12%組的Shannon指數均低于對照組，說明貯藏和干制都會降低微生物的多樣性。對照、脫水6%和12%組初始相對豐度最大的菌屬分別為Rhodococcus、Aeromonas和Macrococcus，相對豐度分別為21.56%、23.88%和79.92%(圖5(c))，不同組之間的初始優勢菌群存在很大差異。貯藏13 d后，對照組的優勢菌屬變為Shewanella(相對豐度23.46%)，脫水6%組的優勢菌屬變為Pseudomonas(相對豐度27.42%)，脫水12%組優勢菌屬變為Pseudomonas(相對豐度45.96%)，不同組的菌群發生變化，對照組和2個脫水組的優勢腐敗菌明顯不同。

橫軸的處理表示脫水程度和貯藏時間，如0%,1 d表示對照組貯藏1天。Treatment on the horizontal axis of the figures represents dehydration degrees and storage time.For example,0%,1 d represents the 1st day of storage in the control group.圖5 不同脫水程度生鮮調理草魚肉4 ℃貯藏過程中菌群Alpha多樣性((a)和(b))及屬水平上菌群的相對豐度(c)Fig.5 Alpha diversity estimation of microbiota (including Ace (a)and Shannon (b)indexes), composition,and relative abundance of microbiota at the genus level (c)in fresh prepared grass carp fillets with different dehydration degrees during storage at 4 ℃

4 討 論

4.1 不同脫水程度草魚肉冷藏過程中理化特性的比較

隨著貯藏時間的延長，魚肉的各項品質逐漸劣化。對照組在貯藏末期肉色發綠，肌肉軟化，表面粘液較多，氨味濃郁。脫水6%和12%組經過干燥后色澤變黃，質地變硬，在貯藏末期表面粘液產生少。與對照組相比，貯藏末期脫水6%和12%組的質地評分和總體可接受度更高。Wan等[15]也發現熱風干燥的草魚肉黃度值更大，魚肉色澤發黃與干燥溫度、干燥方式以及水分蒸發量有關[16]。脫水6%和12%組的TVB-N質量分數和b(TCA-可溶性肽)高于對照組，且脫水程度越大，其含量越高，這與Kim等[5]的研究結果相似，可能是因為熱風干燥的溫度適宜微生物的生長，同時一些蛋白酶的活性增強，二者的共同作用促進了魚肉蛋白質的降解[17]，使得脫水6%和12%組的TVB-N質量分數和b(TCA-可溶性肽)高于對照組。在貯藏過程中ATP被降解為二磷酸腺苷ADP、一磷酸腺苷AMP、IMP、HxR和Hx[18]。隨著貯藏時間的延長，不同脫水程度組的b(IMP)持續降低，脫水6%和12%組在貯藏前5天b(IMP)顯著低于對照組(P<0.05)，可能是由于在干燥過程中溫度適宜，與IMP降解相關的酶活性增強，促進了IMP的降解。隨著貯藏的進行，脫水6%和12%組的b(HxR)不斷增加，對照組b(HxR)先升高后降低，b(HxR)后期降低是因為HxR被降解為Hx，脫水6%和12%組的b(HxR)在貯藏后期(7～13 d)較高，說明2個脫水組HxR的降解被抑制。HxR降解為Hx主要與微生物有關[14]，脫水組和對照組貯藏后期HxR變化趨勢不同，可能是貯藏末期的優勢腐敗菌不同造成的[11,19]。雖然脫水6%和12%組貯藏后期HxR的降解被抑制，但是脫水12%組的b(Hx)和K值在9和11 d顯著高于另外2組(P<0.05)，脫水6%組的b(Hx)在9、11和13 d比對照組低，其K值在第13天也顯著低于對照和脫水12%組(P<0.05)，說明并非脫水程度越高越好，脫水6%組在抑制HxR降解、Hx的產生和K值增長方面效果更好。貯藏末期脫水6%和12%組的腐胺質量分數低于對照組，脫水6%組的尸胺質量分數也顯著低于對照組和脫水12%組，說明希瓦氏菌產生腐胺和尸胺的能力較強，這與Wang等[20]的研究結果相似，他們發現Shewanellaputrefaciens能產生較多的尸胺。綜合各指標來看，與對照和脫水12%組相比，脫水6%組貯藏末期的感官、TVB-N、TCA-可溶性肽、HxR和Hx等指標優于另外2組。因此，有效控制脫水程度和脫水時間有助于生鮮調理草魚肉貯藏品質的提升，但是脫水12%組未能達到理想效果，可能是因為脫水12%組所需的干燥時間稍長，且本研究采用的干燥溫度稍高，干燥條件適宜魚肉中微生物的生長及相關酶活性的增強，從而未能提升草魚肉的貯藏品質。為提升草魚肉干制后的貯藏品質，后期應進一步探討更低脫水程度和更低脫水溫度對生鮮調理草魚肉品質的影響。

4.2 不同脫水程度草魚肉冷藏過程中微生物特性的比較

在貯藏初期，脫水6%和12%組菌落總數高于對照組，可能是空氣中存在一定量的微生物，魚肉在干燥時不可避免的和空氣接觸而沾染到了，導致其初始菌落總數較高。雖然經過干燥其初始菌落總數較高，但是在貯藏中后期脫水6%和12%組的菌落總數和對照組無顯著差異(P>0.05)，說明干燥后魚片的微生物在貯藏過程中生長較慢，干燥對貯藏過程中微生物生長具有一定的抑制作用。

假單胞菌、氣單胞菌、希瓦氏菌是生鮮魚肉中常見的3種優勢腐敗菌[21-22]，在初始時對照、脫水6%和12%組主要菌屬分別為Rhodococcus、Aeromonas和Macrococcus。在腐敗時生鮮魚肉中常見的腐敗菌逐漸占優勢，對照組的優勢腐敗菌為Shewanella，而脫水6%和12%組的優勢腐敗菌為Pseudomonas，脫水組和對照組的優勢腐敗菌明顯不同，說明干燥改變了生鮮調理草魚肉的菌群結構。

5 結 論

干燥能夠改變生鮮調理草魚肉的菌群結構，對照組的優勢腐敗菌為Shewanella，脫水6%和12%組的優勢腐敗菌均為Pseudomonas。干燥對魚肉中細菌的抑制作用不明顯，對TVB-N和TCA-可溶性肽的產生、IMP的降解以及K值的增長無明顯抑制作用，但是經過干燥可以有效提高生鮮調理草魚肉的感官品質，其質地評分和總體可接受度更高，貯藏后期HxR降解緩慢，腐胺和尸胺的產生較少。然而并非脫水程度越高越好，以本研究結果看，脫水6%組能在一定程度上延緩生鮮調理草魚肉的腐敗變質。