‘玫瑰香’葡萄果實成熟過程中質(zhì)地與解剖結(jié)構(gòu)的變化

賈 楠 尹勇剛 李敏敏 劉長江 韓 斌 孫 艷 趙勝建 郭紫娟

(河北省農(nóng)林科學院 昌黎果樹研究所，河北 昌黎 066600)

果實質(zhì)地是一個綜合的果實性狀，對果實口感有很大影響，是蘋果[1]、桃[2]、梨[3]、香蕉[4]、藍莓[5]、楊梅[6]、芒果[7]、草莓[8]和葡萄[9]等果實品質(zhì)的重要評價指標，同時對果實運輸、加工、貯藏保鮮和貨架期的長短也有顯著影響。葡萄果實屬于典型的漿果，果實質(zhì)地具有皮薄多汁和果肉柔軟的特點[10]，在采后運輸和貯藏期間更易出現(xiàn)擠壓變形、失水萎蔫,甚至腐爛變質(zhì)現(xiàn)象[11]。因此，亟需研究葡萄果實質(zhì)地發(fā)生變化的機制，為葡萄質(zhì)地改良育種奠定基礎。

果實質(zhì)地主要由細胞間結(jié)合力、細胞壁物質(zhì)的機械強度以及細胞大小和形狀等因素決定[12]。在蘋果上研究發(fā)現(xiàn)，水溶性果膠、離子型果膠及纖維素含量差異是蘋果質(zhì)地差異的關(guān)鍵因子[13],果肉細胞顯微結(jié)構(gòu)及一些細胞壁相關(guān)代謝酶的差異與蘋果質(zhì)地變化密切相關(guān)[14]。在藍莓上研究發(fā)現(xiàn)，果實硬度的降低伴隨著水溶性果膠的增加及纖維素和半纖維素的減少[15-16]。此外，果實質(zhì)地也受基因調(diào)控。果實質(zhì)地發(fā)育的差異是多種基因協(xié)同作用的結(jié)果，其中多聚半乳糖醛酸酶(PG)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)和葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(XET)基因等在蘋果質(zhì)地發(fā)育中起關(guān)鍵作用[17]。目前，關(guān)于果實質(zhì)地變化的研究多集中在生理代謝[13-16,18]和基因調(diào)控[17,19]方面，且在蘋果和藍莓上研究較多。從結(jié)構(gòu)決定功能角度分析，果實結(jié)構(gòu)的變化是影響果實質(zhì)地的細胞學基礎，而目前關(guān)于葡萄果實顯微結(jié)構(gòu)與質(zhì)地變化關(guān)系的研究相對欠缺。本研究利用質(zhì)地多面分析法(TPA)和石蠟切片法，對‘玫瑰香’葡萄果實成熟過程中的質(zhì)地參數(shù)和果實細胞的解剖結(jié)構(gòu)進行了研究，并對果實基本性狀進行了測定，以期闡明葡萄果實成熟中質(zhì)地參數(shù)與果實顯微結(jié)構(gòu)的變化及兩者的相關(guān)關(guān)系，為解析葡萄果實質(zhì)地的細胞學研究奠定基礎，進而為葡萄果實質(zhì)地改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究在河北省農(nóng)林科學院昌黎果樹研究所施各莊基地(39°47′ N，119°20′ E)進行。年平均氣溫12.24 ℃，太陽日平均有效輻射165 μmol/(m2·s)，降水總量601.8 mm。試驗于2019年進行，以5年生葡萄品種‘玫瑰香’為試驗材料，于幼果期(S1)、轉(zhuǎn)色期(S2)、成熟前2周(S3)和成熟期(S4)進行果實采樣。試驗區(qū)為露地棚架栽培，株行距0.7 m×4.0 m，正常水肥管理。土壤為砂壤土，0～60 cm土壤的pH為5.88。土壤中有機質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)為1.79%，氮的質(zhì)量分數(shù)為0.15%，磷的質(zhì)量分數(shù)為1.28 mg/kg,鉀的質(zhì)量分數(shù)為1.98 mg/kg。土壤排水灌溉條件良好。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設計

試驗采用完全隨機區(qū)組設計，3次重復，每個重復選取5棵樹。每棵葡萄樹隨機采3穗果，每個果穗從上中下共采集10粒果，進行果實品質(zhì)、質(zhì)地和解剖結(jié)構(gòu)的測定，每個指標測定3次生物學重復。

1.2.2葡萄果實基本品質(zhì)測定

單果重采用電子天平測定，單果重=30粒總重量/30。每次生物學重復隨機選取10粒果實進行果實縱橫徑、可溶性固形物和可滴定酸含量的測定。其中果實縱橫徑采用游標卡尺進行測定，可溶性固形物含量采用糖度計(PAL-1,日本)測定，可滴定酸含量采用果實酸度計測定(GMK-835F,韓國)。

1.2.3質(zhì)地多面分析法測定葡萄果實質(zhì)地

每次生物學重復將隨機選取20粒果實進行質(zhì)地測定。葡萄果實樣品置于質(zhì)地分析儀(CT3,美國)平板上，采用TA25/1000柱頭進行測定。參數(shù)設置如下：預壓速度、下壓速度和壓后上行速度均為2.0 mm/s，2次壓縮間停頓5.0 s，試樣受壓形變?yōu)?5%，觸發(fā)力為5 g。由質(zhì)地曲線得到果實硬度、內(nèi)聚性、彈性和咀嚼性4個參數(shù)，用于后續(xù)分析。其中，硬度為第1次壓縮時的最大峰值，內(nèi)聚性為2次壓縮面積之比，彈性為第1次循環(huán)目標形變至第2次循環(huán)觸發(fā)點間的位移，咀嚼性=硬度×內(nèi)聚性×彈性。

1.2.4葡萄果實細胞解剖結(jié)構(gòu)的觀察

每次生物學重復隨機選取20粒進行果實結(jié)構(gòu)的觀察。果實結(jié)構(gòu)的觀察采用石蠟切片法[20-21]，從果實赤道處垂直果皮切取大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的方塊(包含果皮和果肉)，立即放入甲醛-乙酸-乙醇(FAA)固定液,抽氣后固定待用；然后經(jīng)過酒精梯度脫水，石蠟包埋，切片(厚度為10 μm),番紅-固綠染色，中性樹膠封片，用顯微鏡(Olympus BX51,日本)觀察果實細胞結(jié)構(gòu)并拍照。用SPOT軟件測量果實細胞形態(tài)學參數(shù)(表皮和亞表皮厚度、細胞面積、周長、縱徑和橫徑)。

表皮和亞表皮細胞排列方式為較疏松、緊密、致密、較致密和非常致密，果肉細胞排列方式為不均勻松散和均勻緊密。

1.3 統(tǒng)計分析

使用Excel軟件和SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)的分析和處理，利用Duncan’s檢驗差異顯著性(P=0.05)，并用Excel軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘玫瑰香’葡萄果實成熟過程中果實品質(zhì)的變化

隨著‘玫瑰香’果實的成熟，果實的單果重(圖1(a))和可溶性固形物含量均顯著增加(圖1(b))，可滴定酸含量顯著降低(圖1(b))，且三者均在幼果期到轉(zhuǎn)色期變化幅度最大。從幼果期到轉(zhuǎn)色期果實的縱徑和橫徑顯著增加，縱橫比顯著下降，而從成熟前兩周到成熟期果實的縱徑、橫徑及縱橫比變化不顯著(圖1(c))。綜合來看，‘玫瑰香’果實在成熟過程中，以轉(zhuǎn)色期為臨界點，幼果期到轉(zhuǎn)色期果實品質(zhì)發(fā)生了顯著變化，轉(zhuǎn)色后，變化趨勢變緩；此外果實在增長的同時，果粒變圓，口感變甜。

2.2 ‘玫瑰香’葡萄果實成熟過程中果實質(zhì)地的變化

‘玫瑰香’果實成熟過程中，果實硬度呈下降趨勢，幼果期到轉(zhuǎn)色期，果實硬度急劇下降，轉(zhuǎn)色后至成熟期果實硬度差異不顯著(圖2(a))。這表明，在果實成熟過程中，果實在轉(zhuǎn)色期迅速軟化，而后趨于平緩。內(nèi)聚性與硬度變化規(guī)律相反呈上升趨勢，幼果期到轉(zhuǎn)色期，果實內(nèi)聚性顯著提高(圖2(b))。內(nèi)聚性為咀嚼果實時，果實抵抗受損，使果實保持完整的性質(zhì)，可反映果實細胞間結(jié)合力的大小，這表明果實細胞間結(jié)合力在幼果期到轉(zhuǎn)色期迅速上升；而轉(zhuǎn)色期至成熟期果實內(nèi)聚性無顯著變化(圖2(b))。彈性的變化趨勢與內(nèi)聚性相似，隨著果實成熟，彈性呈上升趨勢，在幼果期到轉(zhuǎn)色期增幅最大(圖2(c))，而在成熟前2周到成熟期彈性無明顯差異。彈性為果實經(jīng)過第一次壓縮后能夠再恢復的程度，這表明在幼果期到轉(zhuǎn)色期果實受壓后恢復能力明顯增強。咀嚼性在果實成熟過程中整體呈下降趨勢，在轉(zhuǎn)色期達到最低，而后上升，成熟時又降低(圖2(d))。這是由于咀嚼性為硬度、內(nèi)聚性和彈性的乘積，轉(zhuǎn)色期果實硬度急劇降低占據(jù)主導，使得咀嚼性在轉(zhuǎn)色期最低；在轉(zhuǎn)色后，彈性增加并占主導地位，使得咀嚼性升高；而后，硬度降低又占主導，使得成熟時果實咀嚼性降低。

S1、S2、S3和S4分別表示幼果期、轉(zhuǎn)色期、成熟前兩周和成熟期。圖中不同時期的不同字母表示數(shù)據(jù)存在顯著性差異(P=0.05)；下同。TSS：可溶性固形物；TA：可滴定酸。S1,S2,S3 and S4 represent young fruit stage,veraison,two weeks before mature stage,and mature stage,respectively.Different letters in different periods in the figure mean significant differences at 0.05 level;The same below.TSS,soluble solids;TA,titratable acid.圖1 ‘玫瑰香’葡萄果實成熟過程中果實單果重(a)、糖酸質(zhì)量分數(shù)(b)和果實縱橫徑(c)的變化Fig.1 The changes of berry weight (a),the mass fraction of TSS and TA (b),and diameter of fruit (c)of ‘Muscat Hamburg’grapevine during fruit ripening

圖2 ‘玫瑰香’葡萄果實成熟過程中果實硬度(a)、內(nèi)聚性(b)、彈性(c)和咀嚼性(d)的變化Fig.2 The changes of berry firmness (a),cohesiveness (b),springiness (c)and chewiness (d)of ‘Muscat Hamburg’grapevine during fruit ripening

2.3 ‘玫瑰香’葡萄果實成熟過程中果皮細胞結(jié)構(gòu)的變化

從果皮結(jié)構(gòu)(表皮和亞表皮)看，‘玫瑰香’果實的表皮和亞表皮在幼果期細胞排列非常致密，細胞較小，在轉(zhuǎn)色期細胞排列緊密，細胞變大，轉(zhuǎn)色后細胞排列較為疏松，細胞較大(表1)。表皮細胞面積在果實成熟過程中顯著增加，幼果期表皮細胞面積為138.80 μm2，而成熟期為263.09 μm2；亞表皮細胞面積與表皮細胞面積變化規(guī)律一致，由幼果期的1 507.67 μm2增長到成熟期的2 160.31 μm2。表皮細胞層數(shù)在果實成熟過程中未發(fā)生變化，為2～3層；而表皮細胞厚度隨著果實成熟，顯著降低，在幼果期表皮細胞厚度為28.33 μm，而成熟期為22.94 μm；其中從幼果期到轉(zhuǎn)色期下降幅度最大，達到了16.01%(表1)。亞表皮細胞層數(shù)在幼果期為9～10層，而從轉(zhuǎn)色期開始直至成熟減少為6～7層；亞表皮細胞厚度從幼果期到轉(zhuǎn)色期顯著減少，由173.15 μm減少為142.65 μm，而轉(zhuǎn)色期至成熟期無明顯變化。以上表明，‘玫瑰香’果實在成熟過程中，由于表皮細胞和亞表皮細胞厚度的下降，亞表皮層數(shù)的減少，使得果皮變薄。

表1 ‘玫瑰香’葡萄成熟過程中果皮細胞形態(tài)的變化Table 1 Changes of pericarp cell morphological parameters of ‘Muscat Hamburg’grapevine during fruit ripening

2.4 ‘玫瑰香’葡萄果實成熟過程中果肉細胞結(jié)構(gòu)的變化

果肉細胞在幼果期排列均勻緊密，細胞較小；從轉(zhuǎn)色期至成熟期，細胞排列不均勻松散，細胞較大(表2)。果肉細胞的面積在果實成熟過程中顯著增加，由幼果期的17 559.96 μm2增加至成熟期的29 091.42 μm2；其中，幼果期到轉(zhuǎn)色期果肉細胞面積增長幅度最大，可達41.26%(表2)。果肉細胞周長和縱徑與果肉細胞面積變化規(guī)律一致，隨著果實的成熟，也顯著增加，且在幼果期至轉(zhuǎn)色期漲幅最多，分別增長了23.38%和36.16%。果肉細胞橫徑隨著果實成熟也顯著增加，由幼果期的134.62 μm增加至成熟期的195.27 μm；在轉(zhuǎn)色期到成熟前兩周，果肉細胞橫徑增長最快，增長了16.71%。果肉細胞縱橫比在幼果期最小，比值為1.15，細胞近圓形；在轉(zhuǎn)色期最大，比值為1.46，細胞近長圓形；這與幼果期到轉(zhuǎn)色期果肉細胞縱徑增加幅度高于橫徑有關(guān)。

表2 ‘玫瑰香’葡萄成熟過程中果肉細胞形態(tài)的變化Table 2 Changes of flesh cell morphological parameters of ‘Muscat Hamburg’grapevine during fruit ripening

2.5 ‘玫瑰香’葡萄果實成熟過程中質(zhì)地參數(shù)與果實細胞形態(tài)學參數(shù)的相關(guān)性分析

果實硬度和咀嚼性均與表皮細胞厚度和亞表皮細胞厚度呈極顯著正相關(guān)(硬度的相關(guān)系數(shù)為 0.947 和0.907，咀嚼性的相關(guān)系數(shù)為0.864和0.865)；與表皮細胞面積、亞表皮細胞面積及果肉細胞形態(tài)指標呈極顯著負相關(guān)(硬度的相關(guān)系數(shù)為-0.938～-0.554，咀嚼性的相關(guān)系數(shù)為-0.881～-0.524)(表3)。果實內(nèi)聚性和彈性均與表皮細胞厚度和亞表皮細胞厚度呈極顯著負相關(guān)(內(nèi)聚性的相關(guān)系數(shù)為-0.934和-0.902，彈性的相關(guān)系數(shù)為-0.926和-0.814)，與表皮細胞面積、亞表皮細胞面積及果肉細胞形態(tài)指標呈顯著正相關(guān)(內(nèi)聚性的相關(guān)系數(shù)為0.558～0.914，彈性的相關(guān)系數(shù)為0.224～0.919)。綜合來看，表皮細胞厚度和果肉細胞縱徑與果實質(zhì)地參數(shù)相關(guān)系數(shù)相對比較高。綜上說明，‘玫瑰香’果實成熟過程果實解剖結(jié)構(gòu)對果實質(zhì)地有顯著的影響，即隨著果實成熟，果實硬度降低，口感變軟，果皮變薄，果皮細胞和果肉細胞增大。

表3 ‘玫瑰香’葡萄成熟過程中質(zhì)地與果實細胞形態(tài)的相關(guān)性Table 3 Correlations between berry cell morphological parameters and texture parameters of ‘Muscat Hamburg’grapevine during fruit ripening

3 討論與結(jié)論

果實質(zhì)地是果實品質(zhì)性狀的重要影響因子之一。本研究發(fā)現(xiàn)，‘玫瑰香’果實成熟過程中，果實硬度和咀嚼性呈下降趨勢，而果實內(nèi)聚性和彈性呈上升趨勢，表明‘玫瑰香’果實成熟過程中，果實質(zhì)地發(fā)生了顯著變化，這與前人在蘋果[14]和梨[22]上研究結(jié)果一致。此外,本研究發(fā)現(xiàn),‘玫瑰香’果實質(zhì)地發(fā)生變化轉(zhuǎn)折點為轉(zhuǎn)色期，由幼果期到轉(zhuǎn)色期果實質(zhì)地變化劇烈，轉(zhuǎn)色期后變化趨于平緩。可能有以下原因：其一，葡萄果實轉(zhuǎn)色期伴隨著果實內(nèi)部一系列生理生化指標的改變，包括可溶性固形物的急劇積累[23-24]、有機酸的分解[25]和總酚物質(zhì)的減少[26]等，這些變化與細胞溶質(zhì)勢和壓力勢密切相關(guān)[27-28]，直接影響細胞水勢。因此，葡萄果實轉(zhuǎn)色期的質(zhì)地變化較大，可能與該時期的果實內(nèi)部物質(zhì)代謝導致細胞水勢改變相關(guān)，需要進一步驗證。其二，‘玫瑰香’葡萄果實成熟過程中，果實解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大變化。果皮細胞和果肉細胞排列變疏松，細胞面積變大，果皮厚度減少，且在轉(zhuǎn)色期變化幅度最大。進一步相關(guān)性分析表明，果實硬度和咀嚼性與果皮(表皮和亞表皮)厚度呈極顯著正相關(guān)，與果皮細胞面積及果肉細胞面積、周長、縱徑、橫徑和縱橫比呈極顯著負相關(guān)；果實內(nèi)聚性和彈性與果皮厚度呈極顯著負相關(guān)，與果皮細胞面積及果肉細胞面積、周長、縱徑、橫徑和縱橫比呈顯著正相關(guān)。其中表皮細胞厚度和果肉細胞縱徑與果實硬度、咀嚼性、內(nèi)聚性和彈性相關(guān)性較高，相關(guān)系數(shù)的絕對值在0.864以上。這說明果皮厚度、果肉細胞形狀和大小對果實質(zhì)地有顯著影響。

本研究表明,隨著‘玫瑰香’果實質(zhì)地變軟，表皮細胞和亞表皮細胞厚度減少,亞表皮細胞層數(shù)降低，細胞排列變疏松，細胞面積變大。在西瓜[29]和蘋果[30]上發(fā)現(xiàn)果皮細胞較厚且果皮細胞排列緊密的品種的果實耐擠壓特性較好，這與本研究結(jié)果相似。進一步相關(guān)分析表明，果實質(zhì)地指標與果皮細胞參數(shù)呈極顯著相關(guān)，且果皮(表皮和亞表皮)細胞與果實質(zhì)地的相關(guān)性整體上高于果皮細胞面積與果實質(zhì)地相關(guān)性，這說明相比于果皮細胞面積，果皮厚度對‘玫瑰香’果實質(zhì)地的影響較大。此外，在‘玫瑰香’果實成熟過程中，果實質(zhì)地變軟，果肉細胞變化與果皮細胞變化一致，排列變疏松，細胞變大，這與前人在蘋果[14]和桃[31]上研究結(jié)果一致。相關(guān)性分析結(jié)果表明，果實質(zhì)地指標與果肉細胞參數(shù)呈極顯著相關(guān)，且與果肉細胞面積和縱徑相關(guān)性較高。在甜瓜上發(fā)現(xiàn)果肉細胞形態(tài)學參數(shù)與質(zhì)地參數(shù)相關(guān)，其中只有部分果肉細胞形態(tài)學參數(shù)與質(zhì)地參數(shù)達到顯著或極顯著水平[32]，這與本研究結(jié)果不一致。可能與2次實驗取樣時間差異有關(guān)，本實驗取樣至成熟期結(jié)束，而上述試驗取樣至衰老期，在此基礎上進行分析可能會對結(jié)果有一定影響。

綜上所述，‘玫瑰香’果實成熟過程中，果實質(zhì)地與果實解剖結(jié)構(gòu)均發(fā)生顯著變化，果實質(zhì)地由硬變軟，果皮變薄，果皮和果肉細胞變大，排列變疏松。進一步分析表明，果實質(zhì)地與果實細胞形態(tài)顯著相關(guān)，其中果皮厚度及果肉細胞橫徑和面積指標相關(guān)性較好。因此，在今后葡萄質(zhì)地育種中，可結(jié)合果皮和果肉的細胞解剖形態(tài)對果實質(zhì)地進行綜合判斷。此外，除了果實細胞的解剖形態(tài)以外，細胞的超微結(jié)構(gòu)也可能與葡萄果實質(zhì)地有關(guān)。在蘋果上通過激光共聚焦顯微鏡對果肉細胞結(jié)構(gòu)進行觀察，結(jié)果表明細胞間隙與果實硬度呈極顯著負相關(guān)[33]。通過掃描電鏡觀察不同質(zhì)地的蘋果果實斷裂面，發(fā)現(xiàn)斷裂面差異明顯[34]。本試驗采用的光學顯微鏡無法對細胞超微結(jié)構(gòu)進行精準測定和評價，因此在今后實驗中，可采用高分辨率的顯微鏡對果實細胞超微結(jié)構(gòu)進行觀察，為解析果實質(zhì)地提供理論依據(jù)，以期加快質(zhì)地育種進程。