miR-29a miR-126a-5p miR-21-3p在重癥急性胰腺炎中的表達及相關(guān)性研究

張倩倩, 王成立, 伏 添, 呂 杰

(1.陜西省漢中市三二〇一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科, 陜西 漢中 723000 2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科， 陜西 西安 710061)

重癥急性胰腺炎是一種高分解代謝性的嚴重疾病，約占整個急性胰腺炎的10%～20%，患者主要臨床表現(xiàn)為腹痛、高熱、消化道出血等，具有發(fā)病速度快、預(yù)后差、致死率高等特點，易合并伴有代謝功能紊亂、臟器功能障礙等癥狀[1]。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，膽道疾病、暴飲暴食、酗酒等為主要發(fā)病因素，總體死亡率高達17%，嚴重威脅著患者的生命安全[2]。準確、客觀的評估重癥急性胰腺炎的嚴重程度，對于治療以及降低重癥急性胰腺炎死亡率具有重要意義[3]。近年來隨著對微小RNA的深入研究，發(fā)現(xiàn)微小RNA可調(diào)控編碼區(qū)RNA，從而對重癥急性胰腺炎產(chǎn)生影響，微小RNA選取方便，有助于重癥急性胰腺炎的臨床診斷。已有相關(guān)研究證實miR-29a、miR-126a-5p、miR-21-3p在重癥急性胰腺炎中表達異常，但三者的相關(guān)性研究鮮有報道[4]。本研究中對miR-29a、miR-126a-5p、miR-21-3p表達進行檢測，旨在探究miR-29a、miR-126a-5p、miR-21-3p在重癥急性胰腺炎的表達及三者在該病中的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1材料:選取2020年3月至2021年3月于我院收治的急性胰腺炎患者82例作為觀察組，其中輕癥急性胰腺炎患者43例，作為MAP組，重癥急性胰腺炎患者39例，作為SAP組，另外選取同期正常體檢者40例，作為對照組。觀察組82例，男45例，女37例，年齡45～71歲，平均年齡(58.1±10.4)歲，病程3～15h，平均病程(9.1±4.8)h，對照組40例，男21例，女19例，年齡43～70歲，平均年齡(56.5±10.8)歲。Balthazar CT分級系統(tǒng)對急性胰腺炎患者進行分級，APACHEⅡ、RANSON評分系統(tǒng)對急性胰腺炎患者進行評分。兩組研究對象一般資料對比，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。本研究所有受試對象均知情并同意。納入標準：所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會外科學(xué)分會胰腺外科學(xué)組制定的急性胰腺炎診治指南[5]，確診為急性胰腺炎患者，患者病歷資料齊全，均意識清醒。排除標準：①患有急性膽囊炎者；②患有肝腎功能障礙者；③長期服用激素者；④患有心腦血管疾病者；⑤患有精神障礙者。

1.2檢測方法

1.2.1標本采集:重癥急性胰腺炎患者在入院后次日采集空腹靜脈血5mL，對照組在體檢當天采集空腹靜脈血5mL，均保存在EDTA抗凝管內(nèi)，進行離心處理(轉(zhuǎn)速3000 r/min、離心半徑15 cm)，提取上清液放置于-60℃恒溫箱內(nèi)備用。

1.2.2實時熒光定量法檢測miR-29a、miR-126a-5p、miR-21-3p水平:取200μL凍存的上清液室溫放置5min，加入細胞裂解液將待測上清液進行裂解，靜置10min，加入60μL氯仿，蓋緊管蓋，手動劇烈震蕩均勻，27℃孵育靜置3min，4℃下離心，上層水轉(zhuǎn)移至離心管中，加入相同體積的異丙醇君合，恒溫靜置10min,4℃下離心，移去上清液，加入75%乙醇清洗RNA沉淀，4℃下離心，吸取乙醇溶液，室溫干燥10min，加入無RNA酶水反復(fù)吹打，使其完全溶解，獲得RNA溶液。加入20μL熒光劑，30ng cDNA和上下游引物(miR-29a上游引物:5＇-CCTAGCACCATCTGAAATCG-3＇，下游引物:5＇-GTGCAGGGTCCGAGG-3＇；miR-126a-5p上游引物：5＇-GGGAAUAGUAGCUGUCAAATT-3＇，下游引物：5＇-UUUGACAGCUACUAUUCCCTT-3＇；miR-21-3p上游引物：5'-ACTCCTACGACTTAGACATG-3'，下游引物：5'-GACTGTATGCTGTCGTAG-3'；U6上游序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。)按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海恒遠生物有限公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,實時熒光定量法反應(yīng)體系:6μL SYB R Premix Ex Taq Ⅱ(2×)，2μL cDNA，1μL上下游引物，0.5μL ROX Reference Dye Ⅱ(50×)，4μL ddH2O,完成后將其放入PCR儀上進行反應(yīng)。采用Ct=-klgX0+b線性方程，計算miR-29a、miR-126a-5p、miR-21-3p表達。

1.2.3APACHEⅡ、RANSON評分系統(tǒng):APACHEⅡ評分包含急性生理評分(APS)、年齡評分、慢性健康評分(CPS)三部分，APS包含體溫、平均動脈壓、心率等12項，總分值0-60分；年齡評分總分值0-6分；CPS包含肝臟、心血管、呼吸等五項，總分值2～5分，理論最高值71分。評分越高患者病情越嚴重，APACHEⅡ最終評分=急性生理評分+年齡評分+慢性健康評分。RANSON評分包含入院時5項臨床檢測包含年齡、WBC、血糖、LDH、SGOT，總分值0～5分；48h的6項指標檢測包含HCT、血鈣、PaO2、BE、Bun增加、體液喪失，總分值0～6分，合計11分。評分越高患者病情越嚴重，重癥急性胰腺炎：評分≥3分。

2 結(jié) 果

2.1兩組研究對象外周血中miR-29a、miR-126a-5p、miR-21-3p表達水平比較:與對照組比較，觀察組miR-29a、miR-21-3p表達水平較高，miR-126a-5p表達水平較低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表1。

表1 兩組研究對象外周血中miR-29a miR-126a-5p miR-21-3p表達水平比較

2.2不同程度急性胰腺炎患者外周血中miR-29a、miR-126a-5p、miR-21-3p表達水平比較:與輕癥急性胰腺炎患者比較，重癥急性胰腺炎患者miR-29a、miR-21-3p表達水平較低，miR-126a-5p表達水平較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表2。

表2 不同程度急性胰腺炎患者外周血中miR-29a miR-126a-5p miR-21-3p表達水平比較

表3 急性胰腺炎患者APACHEⅡ RANSON評分與相關(guān)性比較分)

2.3急性胰腺炎患者APACHEⅡ、RANSON評分與相關(guān)性比較:與輕癥急性胰腺炎患者比較，重癥急性胰腺炎患者APACHEⅡ、RANSON評分較高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。使用Pearson相關(guān)性對APACHEⅡ、RANSON評分相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，APACHEⅡ、RANSON呈現(xiàn)出正相關(guān)(r=0.662；P=0.001)，見表3。

2.4急性胰腺炎患者外周血中miR-29a、miR-126a-5p、miR-21-3p表達與臨床和病理特征的關(guān)系比較:根據(jù)ROC曲線確定的截斷值分別將急性胰腺炎患者分為miR-29a高表達40例、低表達42例；miR-126a-5p高表達35例、低表達47例；miR-126a-5p高表達35例、低表達47例，無統(tǒng)計學(xué)意義差異(P>0.05)。不同CT分級、胸水情況在急性胰腺炎患者例數(shù)比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。不同年齡、性別、病因類型的急性胰腺炎患者例數(shù)比較，無統(tǒng)計學(xué)意義差異(P>0.05)，見表4。

表4 兩組外周血中miR-29a miR-126a-5p miR-21-3p表達水平與臨床和病理特征的關(guān)系比較n(%)

圖1 APACHEⅡ、RANSON相關(guān)性分析

2.5miR-29a、miR-126a-5p、miR-21-3p相關(guān)性分析:使用Pearson相關(guān)性對miR-29a、miR-126a-5p、miR-21-3p相關(guān)性進行分析發(fā)現(xiàn)，miR-29a、miR-126a-5p呈現(xiàn)出負相關(guān)(r=-0.447；P=0.003)；miR-29a、miR-21-3p呈現(xiàn)出正相關(guān)(r=0.534；P=0.001)；iR-126a-5p、miR-21-3p呈現(xiàn)出負相關(guān)(r=-0.517；P=0.001)。見圖2。

圖2 miR-29a、miR-126a-5p、miR-21-3p相關(guān)性分析

3 討 論

重癥急性胰腺炎是急性胰腺炎一種特殊類型，病情險惡、并發(fā)癥較多，主要表現(xiàn)為腹痛、胰腺腫大、神志不清等[6]。重癥急性胰腺炎發(fā)病機制復(fù)雜，可能與胰腺的自身消化、炎性細胞因子等相關(guān)[7]。由于胰管上皮保護層、胰腺腺泡特異的代謝功能等，可防止胰液在體內(nèi)不發(fā)生自身消化；炎性細胞因子相互關(guān)聯(lián)、累積，可導(dǎo)致血管滲漏、多系統(tǒng)器官衰竭等，是急性胰腺炎發(fā)展為重癥的重要因素[8,9]。

miR-29a屬于miR-29家族，位于7號染色體，可調(diào)控胰腺腺泡的表達[10]。有研究顯示，miR-216a在急性胰腺炎患者中表達升高，與病情嚴重程度呈正相關(guān)，在急性胰腺炎診斷中具有重要價值[11]。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-29a在重癥急性胰腺炎患者血清中呈現(xiàn)高表達，且隨著病情的加重miR-29a表達隨之升高，可能是miR-29a表達升高可參與促進胰腺腺泡的凋亡，加速胰腺組織的損傷。

miR-126a-5p屬于miR-126家族，具有調(diào)控血管再生、刺激細胞形成的作用[12]。據(jù)李剛等[13]研究顯示，miR-551-5p、miR-126a-5p在急性胰腺炎患者血清中呈現(xiàn)高表達，miR-551-5p、miR-126a-5p是急性胰腺炎的危險因素，可作為評估患者預(yù)后的潛在指標。本文研究發(fā)現(xiàn)，miR-126a-5p表達隨著病情加重隨之降低。本文研究還發(fā)現(xiàn)，miR-126a-5p水平與重癥急性胰腺炎嚴重程度呈負相關(guān)，可作為重癥急性胰腺炎的檢測指標。miR-126a-5p在重癥急性胰腺炎患者血清中的異常表達，可能是miR-126a-5p可促進炎癥因子表達及激活配對靶基因，使胰腺的相關(guān)蛋白酶活性增強，加重患者病情。

miR-21-3p是一種發(fā)現(xiàn)較早、存在較廣泛的miRNA，可激活PI3KAKT信號通路，調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡[14]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miR-21-3p、miR-551-5p表達隨著急性胰腺炎病情加重而不斷升高，二者聯(lián)合檢測在該疾病的診斷及預(yù)后評估中價值較高[15]。本文研究還發(fā)現(xiàn)，隨著病情加重miR-21-3p表達隨之升高。本文研究還發(fā)現(xiàn)，重癥急性胰腺炎疾病嚴重程度與miR-21-3p表達存在相關(guān)性，該疾病的發(fā)生可能是由于胰腺細胞損傷嚴重，胰腺細胞釋放miRNA到血液，使血清中miR-21-3p水平升高，還可能是由于miR-21-3p高表達與重癥急性胰腺炎患者的炎癥反應(yīng)、胰腺腺泡酶激活相關(guān)，重癥急性胰腺炎發(fā)病后可釋放多種因子，導(dǎo)致miR-21-3p水平上升。

本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-29a、miR-126a-5p、miR-21-3p在重癥急性胰腺炎中表達異常，且miR-29a與miR-126a-5p表達呈負相關(guān)；miR-29a與miR-21-3p表達呈正相關(guān)；miR-126a-5p與miR-21-3p表達呈負相關(guān)。可能是miR-29a高表達可加速胰腺腺泡的凋亡，miR-126a-5p低表達可促進促炎因子的表達，miR-21-3p高表達影響谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性，加重機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，三者共同作用，可促進胰腺組織損傷，共同參與重癥急性胰腺炎病情進展。

本研究由于選取病例較少，存在一定的局限性，且未對患者預(yù)后進行研究，故在下一步研究中可采取大樣本，探究miR-29a、miR-126a-5p、miR-21-3p與重癥急性胰腺炎患者的相關(guān)性及預(yù)后。

綜上所述，miR-29a、miR-21-3p在重癥急性胰腺炎中異常上升，miR-126a-5p在重癥急性胰腺炎中異常下降，且miR-29a、miR-126a-5p、miR-21-3p表達與疾病嚴重程度存在相關(guān)性，有望成為診斷重癥急性胰腺炎的血清分子診斷標志。