乙型肝炎患者血清miR-27a miR-625表達及與肝硬化和肝癌的相關性研究

吳 攀， 劉成敏， 葉知瑤， 吳成鳳， 徐理茂

(成都醫學院第三附屬醫院消化內科， 四川 成都 611730)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是嚴重的公共衛生問題，在機體免疫應答的過程往往會造成肝細胞損傷和破壞，進而引起肝組織發炎，導致一系列癥狀和肝功能檢查異常，即發生乙型肝炎[1]。HBV感染后在多種因素作用下可能逐步演進為慢性肝炎、肝硬化、肝癌。據調查，由于慢性炎癥的反復發作，20%～30%的患者會發展為肝硬化或肝癌[2]。乙型肝炎給患者及社會均帶來了沉重的負擔，研究其發病機制具有重要價值。微小RNA(microRNA，miRNA)是近年來備受關注的一類分子，廣泛參與細胞生長、分化、凋亡、腫瘤發生及病毒感染發病機制等多種生命過程[3]。其中，微小RNA-27a(miR-27a)、微小RNA-625(miR-625)分別在肝癌、肝硬化中差異表達，但在乙型肝炎的表達尚不明確[4,5]。本研究將通過檢測乙型肝炎患者血清miR-27a、miR-625表達水平，研究二者與肝硬化、肝癌的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2019年11月至2021年2月在成都醫學院第三附屬醫院消化內科就診的慢性乙型肝炎患者67例作為乙型肝炎組、乙型肝炎后肝硬化患者63例作為肝硬化組、乙型肝炎后肝癌患者65例作為肝癌組，選取同期健康體檢者65例作為對照組。四組受試者性別、年齡、體質量指數(BMI)比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。納入標準：①慢性乙型肝炎診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》中的相關內容[6]，年齡>40歲；②乙型肝炎后肝硬化診斷符合《肝硬化診治指南》[7]中的相關內容，年齡>40歲；③乙型肝炎后肝癌診斷符合《原發性肝癌診療規范(2019年版)》[8]中的相關內容，且經病理檢查確診；④臨床檢查資料完整者；⑤無精神疾患，可正常溝通。排除標準：①伴有其他惡性腫瘤、其他肝炎病毒感染、其他肝病、嚴重全身性疾病者；②近6個月內使用過干擾素、核苷酸類似物抗病毒治療者；③近6個月內使用過激素等免疫調節劑者；④妊娠婦女。本研究經醫院倫理委員會批準，所有受試者及其家屬簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器:逆轉錄試劑盒(貨號：AB-4366596)購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑盒(貨號：SK1321)、熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green Mix)(貨號：K1002S)購自美國Promega公司；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(型號：ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司。

表1 四組受試者一般資料比較

1.3qRT-PCR法檢測血清miR-27a、miR-625表達水平

1.3.1總RNA提取:四組受試者均于清晨取空腹外周靜脈血5mL，4℃ 3000r/min離心10min，分離血清。按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，加Trizol試劑，3000r/min離心10min，收集上清。用紫外分光光度計測定RNA濃度及純度，以260、280nm波長處RNA樣本吸光度值比值處于1.8～2.0為合格。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。

1.3.2cDNA合成:使用逆轉錄試劑盒將提取的總RNA逆轉錄成cDNA。加1μL總RNA、1μL通用引物、9μL ddH2O于無菌Eppendof管中，置于65℃水中5min，冰上5min；依次加入5×buffer 4μL、RNA酶抑制劑1μL，10mmoL/L dNTP 2μL和逆轉錄酶1μL，使用DEPC水補至20μL，充分混勻后在水浴鍋中42℃水浴60min，70℃水浴5min。使用qRT-PCR儀按45℃ 25min、95℃ 5min進行逆轉錄反應。檢驗合成cDNA的質量，合格后-80℃保存備用。

1.3.3qRT-PCR法檢測miR-27a、miR-625水平:以U6為內參基因，采用qRT-PCR儀對miR-27a、miR-625進行擴增。miR-27a、miR-625、U6上下游引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，10μL反應體系：SYBR Green Mix 5μL、50 ng/μL cDNA 1 μL、10 μM上下游引物各0.5μL、ddH2O 3μL。反應條件：95℃ 90 s；95℃ 30 s，63℃ 30 s，40個循環終止。miR-27a上游引物：5′-GCGCTTCACAGTGGCTAAG-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-625上游引物：5′-AGGGGGAAAGTTCTATAGTCC-3′，下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；內參U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-27a、miR-625相對表達量以2-ΔΔCt法表示，Ct值為擴增產物量達到臨界閾值時對應的循環數。

2 結 果

2.1四組血清miR-27a、miR-625水平:與對照組比較，乙型肝炎組、肝硬化組、肝癌組血清miR-27a水平顯著升高，miR-625水平顯著降低(P<0.05)；與乙型肝炎組比較，肝硬化組、肝癌組血清miR-27a水平顯著升高，miR-625水平顯著降低(P<0.05)；與肝硬化組比較，肝癌組血清miR-27a水平顯著升高，miR-625水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 四組血清miR-27a miR-625水平比較

2.2影響乙型肝炎后肝硬化發生的多因素分析:將乙型肝炎后肝硬化是否發生作為因變量，以血清miR-27a、miR-625水平為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，血清miR-27a水平為影響乙型肝炎后肝硬化發生的獨立危險因素(P<0.05)，血清miR-625水平為影響乙型肝炎后肝硬化發生的保護因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響乙型肝炎后肝硬化發生的多因素分析

2.3ROC曲線分析血清miR-27a、miR-625水平對乙型肝炎后肝硬化發生的預測價值:血清miR-27a水平預測乙型肝炎后肝硬化發生的曲線下面積(AUC)為0.708(95%CI：0.620～0.797)，截斷值為1.24，敏感度為73.02%，特異度為61.19%，約登指數為0.342；血清miR-625水平預測乙型肝炎后肝硬化發生的AUC為0.761(95%CI：0.680～0.843)，截斷值為0.80，敏感度為68.25%，特異度為73.13%，約登指數為0.414。血清miR-27a、miR-625二者聯合預測乙型肝炎后肝硬化發生的AUC為0.815(95%CI：0.743～0.888)，敏感度為65.08%，特異度為85.07%，約登指數為0.502。見圖1。

2.4影響乙型肝炎后肝癌發生的多因素分析:將乙型肝炎后肝癌是否發生作為因變量，以血清miR-27a、miR-625水平為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，血清miR-27a水平為影響乙型肝炎后肝癌發生的獨立危險因素(P<0.05)，血清miR-625水平為影響乙型肝炎后肝癌發生的保護因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響乙型肝炎后肝癌發生的多因素分析

圖1 血清miR-27a、miR-625水平單獨及聯合預測乙型肝炎后肝硬化發生的ROC曲線

2.5ROC曲線分析血清miR-27a、miR-625水平對乙型肝炎后肝癌發生的預測價值:血清miR-27a水平預測乙型肝炎后肝癌發生的AUC為0.870(95%CI：0.812～0.929)，截斷值為1.42，敏感度為79.23%，特異度為66.57%，約登指數為0.458；血清miR-625水平預測乙型肝炎后肝癌發生的AUC為0.913(95%CI：0.864～0.963)，截斷值為0.71，敏感度為76.92%，特異度為72.54%，約登指數為0.495；血清miR-27a、miR-625二者聯合預測乙型肝炎后肝癌發生的AUC為0.966(95%CI：0.938～0.993)，敏感度為73.64%，特異度為89.55%，約登指數為0.632。見圖2。

圖2 血清miR-27a、miR-625水平單獨及聯合預測乙型肝炎后肝癌發生的ROC曲線

3 討 論

HBV是一種親肝且具有泛嗜性的DNA病毒，中國HBV表面抗原攜帶者占全國人口的7.18%[9]。感染HBV后，患者的肝臟經歷反復損傷和修復過程，引發慢性乙型肝炎，可進一步發展為肝硬化及肝癌，嚴重影響患者的生命健康。而在HBV感染后的發展過程中，患者臨床表現不明顯，不易作出準確診斷。因此，尋找與HBV感染后發展過程有關的生物標志物，對防治乙型肝炎進一步發展惡化具有重要意義。

miRNA是一類非編碼小分子單鏈RNA，可在轉錄或翻譯水平上調控相關基因表達，參與腫瘤發生及病毒感染發病機制等過程。據報道，miRNA在HBV引起的肝臟慢性損傷過程中存在差異性表達，參與該進程的發生、發展，且具有更高的組織特異性和可靠性[10]。徐蘭鋒等[11]研究表明，血清miR-122、miR-130a水平對隱匿性乙型肝炎有重要診斷價值。miR-27a、miR-625是癌癥中發揮重要作用的miRNA，在大多數癌癥中差異表達，分別發揮促癌及抑癌作用。有研究表明，miR-27a在食管鱗狀細胞癌中表達上調，而miR-625可抑制非小細胞肺癌的進展[12]。近年研究發現，miR-27a、miR-625在HBV感染發展中差異表達。本研究結果顯示，從對照組、乙型肝炎組、肝硬化組到肝癌組，受試者血清miR-27a水平依次升高，miR-625水平依次降低，提示在乙型肝炎發生及向肝硬化、肝癌進展過程中，miR-27a、miR-625的表達受到嚴重影響，二者很可能參與HBV感染后乙型肝炎、肝硬化、肝癌的發生發展過程。有研究亦表明，miR-27a可促進肝癌細胞增殖[13]。而肝硬化患者miR-625表達下調，可作為肝硬化的生物標志物[5]。回歸分析顯示，血清miR-27a、miR-625水平分別為影響乙型肝炎后肝硬化、肝癌發生的獨立危險因素和保護因素，提示血清miR-27a、miR-625水平的變化可能改變乙型肝炎發生肝硬化、肝癌的可能性，推測通過降低血清miR-27a水平、升高miR-625水平可能有助于預防乙型肝炎進展為肝硬化、肝癌。ROC曲線分析結果顯示，表明血清miR-27a、miR-625對乙型肝炎后肝硬化、肝癌的發生均有一定的預測價值，二者聯合預測乙型肝炎后肝硬化、肝癌發生的效果更好。

綜上所述，隨著乙型肝炎的發生及向肝硬化、肝癌進展，血清miR-27a、miR-625水平分別升高和降低，且兩者分別為影響乙型肝炎后肝硬化、肝癌發生的獨立危險因素和保護因素，對乙型肝炎后肝硬化、肝癌的發生均有一定的預測價值。本研究雖初步明確了miR-27a、miR-625與乙型肝炎進展的關系，但納入樣本量相對較少，可進一步擴大樣本探討兩者在乙型肝炎預后中的作用。