LncRNA H19通過miR-370-3p/RAF1軸對腦膠質瘤T98G細胞增殖侵襲和放療敏感性的影響及機制

徐 華， 張海萍， 楊 苗， 馬 蕾

(1.西安國際醫學中心醫院， 陜西 西安 710100 2.西安交通大學第一附屬醫院干部病房， 陜西 西安 710000)

膠質瘤進展迅速，早期轉移，是中樞神經系統發生最多的惡性腫瘤之一，占顱內腫瘤的50%以上[1]。根據世界衛生組織的病理生長和擴散速度特征，膠質瘤可分級為I ～ IV級。腦膠質瘤的臨床治療以手術切除加放療和化療為主，然而，患者死亡率和復發率很高，預后較差，中位生存時間小于1年[2,3]。因此，了解膠質瘤發生的分子機制和識別早期診斷的生物標志物是非常重要的。長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNAs,lncRNAs)是超過200個核苷酸的轉錄本，并與各種疾病，包括癌癥密切相關[4,5]。lncRNA在各種癌癥類型中均有異常表達。lncRNA作為腫瘤促進或抑制因子，被認為是癌癥診斷的潛在生物標志物[6]。如lncRNA NORAD通過抑制miR-202-5p參與結直腸癌進展[7]。LncRNA HOTTIP通過調控HOXA9調節人胰腺癌的癌癥干細胞特性[8]。越來越多的研究發現LncRNA H19參與了各種腫瘤的進展，如lncRNA H19基因變異與中國人群膀胱癌風險相關[9]。在MCF-7乳腺癌細胞中，lncRNA H19介導17β -雌二醇誘導細胞增殖[10]。然而，關于LncRNA H19在膠質瘤增殖、侵襲及其放療過程中的作用仍不明了。本研究旨在闡明LncRNA H19在膠質瘤細胞發展中的作用，進一步深入探討其作用機制。

1 資料與方法

1.1主要材料:本研究所使用的45例膠質瘤組織和相應的瘤旁正常組織均取自我院接受腦膠質瘤切除術且未接受放療和/或化療的患者，病理檢查顯示相鄰組織為正常腦組織。所有患者術前進行臨床分期，并簽署知情同意書，經過本院倫理委員會批準。從中國科學院上海細胞庫購買腦膠質瘤T98G細胞。DMEM培養基(Dulbecco改良的Eagle培養基)、Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，青霉素和鏈霉素購自美國Gibco公司。CCK-8檢測試劑盒購自美國Sigama公司。H19小干擾RNA質粒及其對照、過表達H19的質粒及其對照，RAF1小干擾RNA質粒及其過表達質粒均來自北京擎科生物公司。miR-370-3p抑制劑及其miR-370-3p模擬物來自美國Genepharma公司。

1.3細胞轉染:H19小干擾RNA質粒及其對照、過表達H19的質粒及其對照、miR-370-3p抑制劑和miR-370-3p模擬物，RAF1小干擾RNA質粒及其過表達質粒均由公司設計及合成。細胞分為①siRNA NC組：T98G細胞轉染2μg siRNA NC質粒；H19 siRNA組：T98G細胞轉染2μg H19 siRNA質粒；RAF1 siRNA組：T98G細胞轉染2μg RAF1 siRNA質粒；②H19 wt+miR-370-3p mimics組：T98G細胞共轉染2μg H19 wt質粒和miR-370-3p mimics；mimics NC+H19 wt組：T98G細胞共轉染2μg H19 wt質粒和mimics NC；H19 mut+miR-370-3p mimics組：T98G細胞共轉染2μg H19 mut質粒和miR-370-3p mimics；mimics NC+H19 mut組：T98G細胞共轉染2μg H19 mut質粒和mimics NC；③inhibitor NC組：T98G細胞轉染2μg inhibitor NC；miR-370-3p inhibitor組：T98G細胞轉染2μg miR-370-3p inhibitor；④pcDNA-3.1(+)+mimics NC組：T98G細胞共轉染2μg pcDNA-3.1(+)質粒和mimics NC；pcDNA-H19+mimics NC組：T98G細胞共轉染2μg pcDNA-H19質粒和mimics NC；pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics組：T98G細胞共轉染2μg pcDNA-3.1(+)質粒和miR-370-3p mimics；pcDNA-H19+miR-370-3p mimics組：T98G細胞共轉染2μg pcDNA-H19質粒和miR-370-3p mimics；⑤RAF1 wt+miR-370-3p mimics組：T98G細胞共轉染2μg RAF1 wt質粒和miR-370-3p mimics；mimics NC+RAF1 wt組：T98G細胞共轉染2μg RAF1 wt質粒和mimics NC；RAF1 mut+miR-370-3p mimics組：T98G細胞共轉染2μg RAF1 mut質粒和miR-370-3p mimics；mimics NC+RAF1 mut組：T98G細胞共轉染2μg RAF1 mut質粒和mimics NC。根據制造商的說明書將質粒利用Lipofectamine 2000轉染至密度為70%左右的T98G細胞中，其中一部分T98G細胞轉染后參照文獻采用不同Gy X射線(0、2、4、6 Gy)垂直照射細胞[11]，采集細胞樣品。

1.4T98G細胞增殖能力測定:CCK-8法檢測細胞增殖。將處于指數生長期的細胞重懸，以4000個/孔接種到96孔板中，另外一組細胞用6 Gy X射線照射，48h后加入10μL CCK-8溶液，在37℃下孵育4h。用分光光度計讀取細胞吸光度值。實驗至少重復3次。

1.5雙熒光素酶報告基因活性檢測:H19序列包含一個假定的miR-370-3p結合位點，被克隆并插入pmirGlO雙熒光素酶miRNA靶表達載體以制備H19 wt，結合位點突變的H19序列同樣用于制備H19 mut。此外構建RAF1 wt和RAF1 mut載體。T98G細胞使用Lipofectamine 2000將LncRNA H19 wt、LncRNA H19 mut分別與miR-370-3p mimics、mimics NC，RAF1 wt、RAF1 mut分別與miR-370-3p mimics、mimics NC共轉染至T98G細胞，熒光素酶活性用雙熒光素酶報告檢測系統測量。

1.6細胞侵襲實驗:為了評估細胞的侵襲情況，轉染24h后，將細胞轉移到無血清培養基中12h。上Transwell室涂上50 μL的Matrigel，在37℃下孵育30min以形成凝膠。下室加入含有10%胎牛血清的培養基，上室加入細胞懸液。在37℃孵育24 h后，用4%對甲醛固定細胞，并用0.1%結晶紫染色，隨機8個視野進行細胞計數。

1.7實時定量PCR (real-time PCR):使用TRIzol試劑從培養細胞或冷凍組織中提取總RNA，根據制造商的說明，用反轉錄試劑盒進行逆轉錄。然后，按照標準的定量PCR程序，使用SYBR Green PCR Master Mix 在實時PCR系統中對LncRNA H19、miR-370-3p和RAF1進行定量PCR。所用引物序列見表1。通過GAPDH作為內參進行相對定量，2-△△Ct法分析結果。

1.8流式細胞儀檢測細胞凋亡率:將T98G細胞用0.25%胰酶消化后進行離心，按照說明書在細胞中加入流式緩沖液，重懸細胞，加入5μL Annexin V-APC后孵育30 min，再加5μL PI染液,5 min后用流式細胞儀進行細胞凋亡率檢測。

表1 引物序列

1.9Western blot:提取總蛋白，通過BCA蛋白分析試劑盒分析蛋白濃度。每個蛋白質樣品在SDS-PAGE凝膠上分離15μg，轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。接下來，PVDF膜與10% BSA孵育，然后與一次和二次抗體孵育，最后進行蛋白曝光。

1.10統計學處理:數據采用SPSS17.0軟件進行分析，用平均數±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1下調LncRNA H19抑制T98G細胞增殖及侵襲，增強其放療敏感性:與瘤旁組織比較，腦膠質瘤組織LncRNA H19 mRNA表達顯著升高，有統計學差異(1.23±0.42 vs 3.15±0.29，t=20.58，P=0.0018<0.01)，與0 Gy劑量X射線照射相比，不同劑量(2 Gy、4 Gy、6 Gy)X射線照射T98G細胞后中H19 mRNA表達顯著降低，有統計學差異(2Gy：1.72±0.87 vs 0.97±0.13，t=18.94，P=0.0028<0.01；4Gy：1.72±0.87 vs 0.74±0.84，t=23.52，P=0.0018<0.01；6Gy：1.72±0.87 vs 0.35±0.05，t=14.27，P=0.0049<0.01)。與siRNA NC組相比，H19 siRNA組T98G細胞活力顯著降低，有統計學差異(62.83±7.54 vs 30.15±4.82，t=22.06，P=0.0020<0.01)，見圖1A。與siRNA NC組相比，H19 siRNA組T98G細胞侵襲數目明顯減少，有統計學差異(80.56±6.35 vs 42.18±3.27，t=19.76，P=0.0026<0.01)，見圖1B-1C。與siRNA NC組相比，siRNA NC+6Gy組細胞活力顯著降低，有統計學差異(82.83±7.54 vs 45.23±5.26，t=17.44，P=0.0033<0.01)，與siRNA NC+6Gy組相比，H19 siRNA+6Gy組細胞活力顯著降低，有統計學差異(45.23±5.26 vs 30.87±6.24，t=9.091，P=0.0119<0.05)，見圖1D。與siRNA NC組相比，siRNA NC+6Gy組細胞凋亡率顯著升高，有統計學差異(5.25±1.23 vs 8.92±2.17，t=17.86，P=0.0032<0.01)，與siRNA NC+6Gy組相比，H19 siRNA+6Gy組細胞凋亡率顯著升高，有統計學差異(8.92±2.17 vs 14.87±5.26，t=13.12，P=0.0058<0.01)，見圖1E-1F。

由上式可知，在一定波長λ時，若氣體的吸收系數α和吸收長度l可以測得，則通過測量光強I和I0的比值得到氣體濃度C。

圖1 LncRNA H19表達下調對T98G細胞增殖及侵襲，增強其放療敏感性的影響

2.2LncRNA H19與miR-370-3p之間的關系:LncRNA H19 3’UTR和miR-370-3p之間存在結合位點，見圖2A。與mimics NC+H19 wt組相比，H19 wt+miR-370-3p mimics組熒光素酶活性顯著降低，有統計學差異(1.17±0.52 vs 3.15±0.29，t=21.34，P=0.0016<0.01)；與mimics NC+H19 mut組相比，H19 mut+miR-370-3p mimics組熒光素酶活性無明顯變化，無統計學差異(1.34±0.09 vs 1.27±0.42，t=2.020，P=0.1808>0.05)，見圖2B。

圖2 LncRNA H19與miR-370-3p靶向結合位點的預測與驗證

2.3下調miR-370-3p促進T98G細胞的增殖及侵襲，降低其放療敏感性:與瘤旁組織比較，腦膠質瘤組織miR-370-3p表達顯著降低，有統計學差異(1.37±0.51 vs 0.52±0.08，t=30.45，P=0.0011<0.01)，與0 Gy劑量X射線照射相比，不同劑量(2 Gy、4 Gy、6 Gy)X射線照射T98G細胞后中miR-370-3p表達顯著升高，有統計學差異(2Gy：1.45±0.82 vs 2.34±0.02，t=13.60，P=0.0054<0.01；4Gy：1.45±0.82 vs2.89±0.93，t=18.01，P=0.0031<0.01；6Gy：1.45±0.82 vs 3.05±1.02，t=18.37，P=0.0030<0.01)。與inhibitor NC組相比，miR-370-3p inhibitor組T98G細胞活力顯著升高，有統計學差異(60.35±8.26 vs 81.23±7.28，t=5.347，P=0.0332<0.05)，見圖3A。與inhibitor NC組相比，miR-370-3p inhibitor組T98G細胞侵襲數目明顯增加，有統計學差異(85.93±8.76 vs 153.48±9.78，t=10.77，P=0.0085<0.01)，見圖3B-3C。與inhibitor NC組相比，inhibitor NC+6Gy組細胞活力顯著降低，有統計學差異(60.35±8.26 vs 30.65±9.23，t=20.36，P=0.0024<0.01)，與inhibitor NC+6Gy組相比，miR-370-3p inhibitor+6Gy組細胞活力顯著升高，有統計學差異(30.65±9.23 vs 58.27±6.27，t=15.94，P=0.0039<0.01)，見圖3D。與inhibitor NC組相比，inhibitor NC+6Gy組細胞凋亡率顯著升高，有統計學差異(7.37±0.97 vs 16.85±5.68，t=15.07，P=0.0044<0.01)，與inhibitor NC+6Gy組相比，miR-370-3p inhibitor+6Gy組細胞凋亡率顯著降低，有統計學差異(16.85±5.68 vs 8.26±4.26，t=12.69，P=0.0062<0.01)，見圖3E-3F。

圖3 miR-370-3p表達下調對T98G細胞增殖及侵襲，降低其放療敏感性的影響

2.4上調LncRNA H19通過miR-370-3p促進T98G細胞增殖、侵襲，降低其放療敏感性:與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-H19+mimics NC組T98G細胞活力顯著升高，有統計學差異(59.87±7.23 vs 82.56±5.48，t=5.073，P=0.0367<0.05)，細胞侵襲數目顯著增加，有統計學差異(78.65±10.23 vs 169.45±12.56，t=18.37，P=0.0030<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics組細胞活力顯著降低，有統計學差異(59.87±7.23±8.76 vs 28.74±6.54，t=18.87，P=0.0028<0.01)，細胞侵襲數目顯著減少，有統計學差異(78.65±10.23 vs 32.47±8.45，t=18.43，P=0.0029<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics組相比，pcDNA-H19+miR-370-3p mimics組細胞活力顯著升高，有統計學差異(28.74±6.54 vs 60.13±5.68，t=19.70，P=0.0026<0.01)，細胞侵襲數目顯著增加，有統計學差異(32.47±8.45 vs 82.37±10.21，t=25.61，P=0.0015<0.01)，見圖4A-4C。與pcDNA-3.1(+)+mimics NC+6Gy組相比，pcDNA-H19+mimics NC+6Gy組細胞活力明顯上升，有統計學差異(43.27±7.82 vs 68.94±5.47，t=21.39，P=0.0022<0.01)，細胞凋亡率明顯降低，有統計學差異(10.26±6.23 vs 5.13±2.04，t=11.08，P=0.0080<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+mimics NC+6Gy組相比，pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics +6Gy組細胞活力明顯降低，有統計學差異(43.27±7.82 vs 22.15±3.27，t=14.27，P=0.0049<0.01)，細胞凋亡率明顯上升，有統計學差異(10.26±6.23 vs 18.79±4.35，t=14.92，P=0.0045<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics +6Gy組相比，pcDNA-H19+miR-370-3p mimics +6Gy組細胞活力明顯上升，有統計學差異(22.15±3.27 vs 60.93±8.72，t=10.17，P=0.0095<0.01)，細胞凋亡率明顯降低，有統計學差異(18.79±4.35 vs 12.36±2.87，t=12.27，P=0.0066<0.01)。

2.5miR-370-3p與RAF1之間的關系:LncRNA H19 3’UTR和miR-370-3p之間存在結合位點，見圖5A。與mimics NC+RAF1 wt組相比，RAF1 wt+miR-370-3p mimics組熒光素酶活性顯著降低，有統計學差異(1.17±0.52 vs 3.15±0.29，t=21.34，P=0.0016<0.01)；與mimics NC+RAF1 mut組相比，RAF1 mut+miR-370-3p mimics組熒光素酶活性無明顯變化，無統計學差異(1.34±0.09 vs 1.27±0.42，t=2.020，P=0.1808>0.05)，見圖5B。

2.6下調RAF1抑制T98G細胞增殖及侵襲，增強其放療敏感性:與癌旁組織比較，腦膠質瘤組織RAF1 mRNA表達顯著升高，有統計學差異(1.34±0.51 vs 2.37±0.81，t=22.47，P=0.0020<0.01)，與0 Gy劑量X射線照射相比，不同劑量(2 Gy、4 Gy、6 Gy)X射線照射T98G細胞后中RAF1 mRNA表達顯著降低，有統計學差異(2Gy：1.63±0.25 vs 1.04±0.24，t=7.653，P=0.0167<0.05；4Gy：1.63±0.25 vs 0.86±0.24，t=14.52，P=0.0047<0.01；6Gy：1.63±0.25 vs 0.42±0.08，t=31.47，P=0.0010<0.01)。與siRNA NC組相比，RAF1 siRNA組T98G細胞活力顯著降低，有統計學差異(58.27±8.92 vs 33.46±5.27，t=25.92，P=0.0015<0.01)，見圖6A。與siRNA NC組相比，RAF1 siRNA組T98G細胞侵襲數目明顯減少，有統計學差異(79.26±7.54 vs 28.93±6.83，t=22.85，P=0.0019<0.01)，見圖6B-6C。與siRNA NC組相比，siRNA NC+6Gy組細胞活力顯著降低，有統計學差異(58.56±8.45 vs 40.18±4.76，t=9.214，P=0.0116<0.05)，與siRNA NC+6Gy組相比，RAF1 siRNA+6Gy組細胞活力顯著降低，有統計學差異(40.18±4.76 vs 22.36±5.27，t=7.799，P=0.0160<0.05)，見圖6D。與siRNA NC組相比，siRNA NC+6Gy組細胞凋亡率顯著升高，有統計學差異(5.25±1.23 vs 8.92±2.17，t=17.86，P=0.0032<0.01)，與siRNA NC+6Gy組相比，RAF1 siRNA+6Gy組細胞凋亡率顯著升高，有統計學差異(8.92±2.17 vs 18.27±5.59，t=21.22，P=0.0022<0.01)，見圖6E-6F。

圖4 LncRNA H19通過miR-370-3p對T98G細胞增殖及侵襲，降低其放療敏感性的影響

圖5 miR-370-3p與RAF1靶向關系的預測與驗證

圖6 RAF1表達下調對T98G細胞增殖及侵襲，增強其放療敏感性的影響

2.7上調LncRNA H19靶向miR-370-3p調控RAF1表達:與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-H19+mimics NC組RAF1 mRNA表達顯著升高，有統計學差異(1.32±0.71 vs 2.39±0.42，t=17.03，P=0.0034<0.01)，pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics組RAF1 mRNA表達顯著降低，有統計學差異(1.32±0.71 vs 0.34±0.04，t=17.58，P=0.0033<0.01)。與pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics組相比，pcDNA-H19+miR-370-3p mimics組RAF1 mRNA表達顯著升高，有統計學差異(0.34±0.04 vs 1.48±0.26，t=15.36，P=0.0036<0.01)，見圖7A。與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-H19+mimics NC組RAF1蛋白表達顯著升高，有統計學差異(0.93±0.53 vs 1.92±0.08，t=19.53，P=0.0026<0.01)，pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics組RAF1蛋白表達顯著降低，有統計學差異(0.93±0.53 vs 0.16±0.02，t=18.37，P=0.0030<0.01)。與pcDNA-3.1(+)+miR-370-3p mimics組相比，pcDNA-H19+miR-370-3p mimics組RAF1蛋白表達顯著升高，有統計學差異(0.16±0.02 vs 0.87±0.35，t=15.94，P=0.0039<0.01)，見圖7B。

圖7 LncRNA H19通過miR-370-3p對RAF1表達的影響

3 討 論

神經膠質瘤是中樞神經系統中最常見的惡性腫瘤。盡管晚期手術和放化療有效，但晚期膠質瘤患者的5年生存率低于6%。已有研究報道lncRNA H19在腫瘤發生和轉移中起著至關重要的作用，Qin等發現lncRNA H19啟動子區域的功能多態性與晚期結直腸癌的癌癥風險和臨床結果有關。還發現LncRNA-H19通過調控miR-124-3p靶向ITGB3調控異位子宮內膜細胞增殖和侵襲[12]。然而，其在膠質瘤組織中的表達及在膠質瘤細胞中的調節機制尚不清楚。在本研究發現lncRNA H19在人腦膠質瘤組織中的表達升高。為了探討lncRNA H19在膠質瘤進展中的生物學功能，我們進行了體外實驗，顯示lncRNA H19的下調抑制了膠質瘤細胞的體外增殖和轉移，而且還發現下調lncRNA H19表達會使X射線照射的T98G細胞凋亡率升高，提高細胞的放射敏感性揭示了lncRNA H19可能作為膠質瘤治療的生物標志物和治療靶點。

lncRNA與miRNAs具有序列互補性，lncRNA可靶向miRNAs調控腫瘤的發展。LncRNA SNHG15通過靶向miR141/PD-L1參與胃癌的免疫逃逸[13]。LncRNA-SNHG6通過靶向miR-6509-5p和HIF1A促進肝癌的發展。在我們的研究中，生物信息分析和熒光素酶報告分析顯示，miR-370-3p是膠質瘤細胞中LncRNA H19的潛在靶點。此外，LncRNA H19的上調與膠質瘤組織中miR-370-3p的下調密切相關。在本研究證實了miR-370-3p是LncRNA H19的直接靶點。生物學功能研究表明下調miR-370-3p促進了T98G細胞增殖和侵襲。此外上調LncRNA H19靶向miR-370-3p促進了T98G細胞增殖和侵襲，降低了T98G細胞的放療敏感性。越來越多的研究表明RAF1參與了各種癌癥的發展。如Zhi等發現吉非替尼通過RAF1/ERK通路逆轉胰腺癌細胞系的多藥耐藥[14]。在人類結直腸癌中，抑制RAF1激酶活性恢復根尖基極性并損害腫瘤生長。CircAGFG1通過miR-370-3p/RAF1信號促進宮頸癌進展[15]。在本研究發現miR-370-3p靶向RAF1，下調RAF1表達后抑制了T98G細胞增殖和侵襲，提高了T98G細胞的放療敏感性，在膠質瘤發展過程中也發揮了重要作用。

總之，在膠質瘤組織和細胞中，lncRNA H19和RAF1表達上調，而miR-370-3p表達下調。我們的研究結果表明，lncRNA H19可以通過結合miR-370-3p，進而上調RAF1的表達，促進膠質瘤細胞的增殖和轉移，這可能是膠質瘤治療的一個很有前景的靶點。