基于D-loop序列和SSR的從江田魚與6個鯉群體的遺傳分析

張顯波，傅建軍，胡錦麗，朱文彬，閔倩雯，趙 飛，吳俁學，董在杰*

(1.貴州省農業科學院 水產研究所，貴州 貴陽 550025；2.中國水產科學研究院 淡水漁業研究中心，農業農村部 淡水漁業與種質資源利用重點實驗室，江蘇 無錫 214081)

0 引言

【研究意義】貴州山區具有悠久的稻田養魚歷史，從江田魚是當地長期選留的地方特色品種，當地又稱之為呆鯉，適宜山區、丘陵稻田養殖。從江田魚具有肉質鮮嫩細膩，無腥味，鱗片薄，個體適中，口感好，風味佳，抗病力強等特點，深受當地養殖戶和消費者喜愛。從江田魚為貴州當地稻田的當家魚種，養殖成本低、投入少、周期短、管理易、效益好。在貴州省黔東南州個別縣份的脫貧攻堅中起到重要作用，也將在鄉村振興中扮演重要角色。從江田魚于2020年被列入全國地理標志農產品，是從江縣“稻魚鴨系統”的重要組成部分(被聯合國糧農組織列為全球重要農業文化遺產)。從江田魚在家養條下連續傳代會引起遺傳多樣性的喪失并導致經濟下降。了解從江田魚的遺傳多樣性可以為其保護策略的制定和未來育種具有重要的指導意義。【前人研究進展】通常采用分子標記評估遺傳多樣性，常用的方法有線粒體DNA和核微衛星(又稱為簡單序列重復標記，SSR)[1-5]。劉志剛等[6]研究發現，羅非魚粵閩1號母本的F2、F4和F63個不同選育世代群體在選育過程中遺傳多樣性出現下降趨勢，遺傳分化不斷加劇。黃新芯等[7]利用Illumina HiSeq TM 2500高通量測序平臺對采自舟山近海的龍頭魚肌肉組織進行轉錄組測序發現，龍頭魚轉錄組SSR位點含量豐富、基元重復類型眾多、重復次數較高，具有良好的分子標記開發潛力；獲得的SSR標記可用于遺傳多樣性和系統發育關系研究。張潤鋒等[8]利用微衛星遺傳標記研究說明三峽庫區人工養殖的歐洲鰉、達氏鱘和雜交鱘具有高度遺傳多態性。胡玉婷等[9]選用10個微衛星標記對9個自然群體共254尾黃顙魚進行遺傳分析結果表明，研究區域內黃顙魚野生資源遺傳多樣性較高，地理群體間存在遺傳分化且部分群體可能經歷了瓶頸效應。鄭翔等[10]利用微衛星標記對4個瓦氏黃顙魚群體進行遺傳評估，研究結果可為長江流域瓦氏黃顙魚的保護、監測和遺傳育種提供分子基礎資料。王耀嶸等[11]利用MISA對金錢魚基因組中微衛星進行篩選并分析分布特征，并利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細管電泳篩選高多態性位點。阮惠婷等[12-20]利用微衛星標記研究不同魚類的遺傳多樣性和遺傳結構。趙立祥等[21-25]結合線粒體D-loop序列和SSR標記分別對寶石鱸、笛鯛屬魚類、沿海大彈涂魚、烏鱧及埃及品系尼羅羅非魚種群遺傳多樣性進行研究?！狙芯壳腥朦c】目前微衛星標記已廣泛用于分析包括魚類的動物遺傳多樣性，將線粒體D-loop序列與微衛星標記結合分析魚類群體遺傳多樣性的研究也有報道，但未見采用線粒體D-loop序列與微衛星標記結合研究從江田魚遺傳多樣性的研究。【擬解決的關鍵問題】采用線粒體D-loop序列和微衛星分析方法，探明從江田魚等7個鯉群體的遺傳多樣性，準確地了解從江田魚群體的遺傳多樣性及種質資源狀況，以期為其品種選育提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鯉魚樣本 從江田魚(CJTY)48尾，采自貴州省黔東南苗族自治州從江縣剛邊鄉平正村；清水江鯉(QSJ)、太湖鯉(THL)、黃河鯉(HHL)、黑龍江鯉(HLJ)、福瑞鯉(FRL)、松浦鏡鯉(SPL)的線粒體D-loop信息[26]和微衛星信息[27]源自前期研究。

1.1.2 儀器設備 NANODROP 2000分光光度儀(美國賽默飛公司)，3730XL測序分析儀(美國ABI公司)。

1.1.3 試劑 TE Buffer(pH 8.0)、無水乙醇、1%瓊脂糖凝膠、PCR Master MIX，均購自北京擎科公司。

1.2 方法

1.2.1 材料預處理

1)基因組DNA的提取與檢測。剪取實驗個體的尾鰭下葉組織，無水乙醇-20℃保存。參照改良的苯酚SDS法[28]提取基因組DNA。提取的DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，濃度及純度由NANODROP 2000分光光度儀測定后，采用TE Buffer(pH 8.0)稀釋至60 ng/μL，-20℃儲存備用。

2)線粒體D-loop序列片段的擴增和測序。利用前期研究設計的引物擴增線粒體D-loop序列片段[26-27](表1)。擴增體系：25 μL PCR Master MIX、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、DNA模板(60 ng/μL)2 μL、21 μL ddH2O。PCR反應程序：94℃預變性5 min；之后進行40個循環(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 50 s)；72℃延伸10 min；4℃保存。將擴增產物送到生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

3)微衛星擴增及基因分型。結合前期研究工作[27]，從中選取11個微衛星位點(表1)進行試驗，設計微衛星引物(5′端用HEX或6-FAM熒光修飾標記)，由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR擴增體系：10 μL PCR Master MIX、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、DNA模板(60 ng/μL)1 μL、8.2 μL ddH2O。PCR反應程序：94℃預變性5 min；之后進行32個循環(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 50 s)；72℃延伸10 min；4℃保存。采用3730XL測序分析儀(ABI)對樣品的熒光PCR產物進行毛細管擴增電泳檢測，結合分子內標進行DNA片段長度計算，根據每個擴增條帶分子量的差異性，判斷個體各基因座的基因型。

表1 用于擴增從江田魚D-loop序列和微衛星序列的引物信息Table 1 Primer information of D-loop sequences and microsatellite loci for amplification of Congjiang C. carpio

1.2.2 群體遺傳分析 使用Cluatal X比對D-loop序列測序結果，并輔以人工校對；采用MEGA 5統計序列的堿基含量。通過DNASP統計單倍型(H)，計算單倍型多樣性(Hd)和核苷酸遺傳多樣性(π)等參數，其中，核苷酸多樣性(π)和線粒體DNA的單倍型多樣性(Hd)是衡量群體DNA多態程度的重要指標，其值越大，則種群或群體的遺傳多樣性水平越高[29-30]。微衛星分析獲得微衛星位點上等位基因的條帶大小后，將所得結果進行歸類。采用POPGENE V1.31進行統計分析，計算各群體每個微衛星位點的等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)及遺傳距離等；采用CERVUS 3.0計算多肽信息含量(PIC)；采用ARLEQUIN 3.5計算遺傳分化指數(FST)，參考BALLOUX等[31]對遺傳分化等級的劃分依據，判定從江田魚與其余鯉群間的分化程度：較低(00.15)遺傳分化；采用MEGA6構建系統發育樹，采用AMOVE進行群體分子方差分析，采用STRUCTURE分析鯉群體的遺傳結構，通過假設K(群體的亞群數)為1～10，結合各K假設條件下計算的似然對數值及δK值(似然值差)，比較鯉群體的遺傳相似度。

2 結果與分析

2.1 從江田魚與6個鯉群體的線粒體DNA D-loop序列

從表2看出，7個鯉群體線粒體DNA D-loop序列中共有46個多態性位點，檢測到41個單倍型。其中，從江田魚有16個單倍型，Hap20和Hap24為其優勢單倍型，分別占個體數的33.33%和20.83%。從江田魚獨立擁有的單倍型最多，為14個。D-Loop序列片段擴增、測序的結果表明，從江田魚的單倍型數(H)和單倍型多樣性指數(Hd)分別為16個和0.829，其中，Hd高于FRL和SPL，但低于其余4個鯉群體；核苷酸遺傳多樣性指數π為0.005，平均核苷酸差異數(G)為4.414；中性檢驗表明，其Tajima’s D為-0.386(P<0.05)。

表2 從江田魚與6個鯉群體中線粒體DNA D-loop序列的單倍型分布Table 2 Haplotype distribution of mt DNA D-loop sequence in Congjiang C. carpio and 6 C. carpio Populations

2.2 從江田魚的微衛星遺傳多樣性

從江田魚的微衛星群體遺傳多樣性分析結果表明，等位基因數(Na)為17.45個，有效等位基因數(Ne)為9.46個，觀測雜合度(Ho)為0.73；期望雜合度(He)為0.90，低于QSJ(0.93)和THL(0.92)，高于其他4個鯉群體；多態信息含量(PIC)為0.82，高于FRL(0.73)和SPL(0.50)，但低于其他4個鯉群體。從表3看出，從江田魚與6個鯉群體的遺傳變異78.49%來自于個體間，10.97%來自于群體內，10.53%來自于群體間。表明，鯉群體的遺傳變異主要來自于個體間。群體間遺傳分化指數(FST)為0.11，說明群體間具有中等程度的遺傳分化，其中，從江田魚與清水江鯉、太湖鯉、黃河鯉、黑龍江鯉的分化程度較低，與福瑞鯉呈中度遺傳分化，從江田魚與松浦鏡鯉間呈高度遺傳分化。由表4可見，從江田魚與6個鯉群體間的遺傳距離為0.466～1.161，其中，與太湖鯉的遺傳距離最小，與福瑞鯉的遺傳距離最大?；贜ei’s遺傳距離構建UPGMA聚類樹(圖1)及主坐標分析PCoA結果(圖2)類似，說明，從江田魚與清水江鯉遺傳差異最小，與松浦鏡鯉遺傳差異最大。結合各K假設的似然對數值及δK值(圖3)看出，當理論群體K為3時，從江田魚、清水江鯉、太湖鯉和黑龍江鯉群體中的個體遺傳結構存在較高遺傳相似度，而黃河鯉個體的遺傳結構存在一定程度的混雜。從圖4看出，通過基因SSR等位基因頻率的群體遺傳結構分析將所有樣本分成3個亞群，從江田魚、清水江鯉、黃河鯉、太湖鯉和黑龍江鯉群體中的大部分個體屬亞群Ⅰ，而福瑞鯉大部分個體屬亞群Ⅱ，松浦鏡鯉的大部分個體屬亞群Ⅲ。表明，與遺傳分化指數及遺傳進化樹的結果均保持一致。

表3 鯉群體基于微衛星標記的分子方差分析Table 3 Analysis of molecular variance of C.carpio populations based on microsatellite markers

表4 從江田魚與6個鯉群體間的遺傳分化指數(FST)和Nei’s遺傳距離(DA)Table 4 Genetic differentiation index (FST)and Nei’s genetic distance (DA)between Congjiang C.carpio and 6 C.carpio populations

圖1 從江田魚與6個鯉群體基于Nei’s遺傳距離構建的UPGMA聚類圖譜Fig.1 UPGMA dendrogram of Congjiang C.carpio and 6 C.carpio populations based on Nei’s genetic distance

圖2 從江田魚與6個鯉群體(A)和個體(B)基于Nei’s遺傳距離的主坐標分析圖譜Fig.2 Principal coordinates analysis of Congjiang C.carpio and 6 C.carpio populations (A)and individuals (B)

圖3 基于不同K值假設的似然對數值和δK值 Fig.3 Likelihood logarithmic value and δK value based on hypothesis of different K values

注：不同顏色代表不同亞群體。Note:Different color indicates different sub-population.圖4 在K=3時從江田魚與6個鯉群體中個體的遺傳結構圖譜Fig.4 Genetic structure of individuals from Congjiang C.carpio and 6 C.carpio populations (K=3)

3 討論

3.1 基于線粒體D-loop序列的從江田魚群體遺傳多樣性

利用線粒體D-loop序列片段(932 bp)結合前期研究的6個鯉群體(清水江鯉、太湖鯉、黃河鯉、黑龍江鯉、福瑞鯉、松浦鏡鯉)的D-loop序列數據[26]分析了從江田魚的群體遺傳多樣性。所有群體線粒體DNA D-loop序列數據中共檢測到41個單倍型，從江田魚有16個，其中，特有的單倍型達14個。從江田魚π值為0.005，Hd為0.829，高于福瑞鯉(932 bp)和松浦鏡鯉(932 bp)，低于其余4個鯉群體[26]。說明從江田魚群體的核苷酸多樣性水平較低，而單倍型多樣性水平較高。與其余6個鯉群體的研究結果相似[26]。出現此現象的原因可能與種群擴張有關[32]，種群數量急劇增加，單倍型多樣性也隨之增加，但核苷酸多樣性卻沒有足夠的時間得到積累[33]所致。

3.2 基于線粒體微衛星位點的從江田魚群體遺傳多樣性

基于微衛星的遺傳多樣性研究中，可以反映遺傳多樣性水平的指標包括等位基因數、雜合度和多態信息含量等[34]。其中，等位基因是基礎，若等位基因數目越多，則代表該群體的遺傳多態性越豐富[35]。研究利用11個微衛星位點對從江田魚進行檢測，結合前期其余6個鯉群體的微衛星數據[22]，共得到338個等位基因，平均等位基因為30.73個。遠大于吳明林等[36]對長江野鯉及2種養殖鯉群體的檢測結果，但是低于全迎春等[37]對黑龍江鯉、散鱗鏡鯉、荷包紅鯉抗寒品系及松浦鏡鯉4個鯉群體的研究結果。出現此結果的原因可能是由于微衛星位點的選擇不同以及試驗樣本數量不同所致。有研究指出，即使同一個微衛星位點，如果選取的樣本數量太少，也會使一些頻率較低的等位基因無法被檢測到[38-39]。

研究檢測的11個微衛星位點的PIC為0.71～0.96，He為0.84～0.95，均>0.5，表明這些位點均為高多態性位點[40]。研究顯示，從江田魚的PIC為0.82，高于福瑞鯉(0.73)和松浦鏡鯉(0.50)，而低于其余4個鯉群體，表明，此7個群體均有較高的遺傳多樣性。從江田魚的期望雜合度為0.90，低于清水江鯉(0.93)和太湖鯉(0.92)，高于其余4個鯉群體[28]，進一步說明從江田魚具有較高遺傳多樣性水平，且其對環境適應能力較強[18]。7個群體間遺傳分化指數為0.11，群體間具有中等遺傳分化水平，其中，從江田魚與清水江鯉、太湖鯉、黃河鯉、黑龍江鯉之間的分化程度較低，與福瑞鯉之間呈中度遺傳分化，從江田魚與松浦鏡鯉呈高度遺傳分化。此外，對其變異來源的分析結果顯示，從江田魚的遺傳變異主要來自于個體間，為進一步開展系統選育提供了豐富遺傳基礎。

基因SSR等位基因頻率的群體遺傳結構分析顯示，所有樣本被分成3個亞群，從江田魚、清水江鯉、黃河鯉、太湖鯉和黑龍江鯉群體中的大部分個體屬亞群Ⅰ，而福瑞鯉大部分個體屬亞群Ⅱ，松浦鏡鯉的大部分個體屬亞群Ⅲ。與遺傳分化指數及遺傳進化樹的結果均保持一致?；贜ei’s遺傳距離構建的UPGMA聚類樹與主坐標分析PCoA結果類似，表明，從江田魚與清水江鯉遺傳差異最小，與松浦鏡鯉遺傳差異最大。此結果也與群體間遺傳分化指數的分析結果一致。研究結果可為從江田魚的種質改良與品種選育提供依據。

4 結論

從江田魚的遺傳多樣性較高，與6個鯉群體的群體間遺傳分化水平中等，與福瑞鯉和松浦鏡鯉的遺傳距離較大，親緣關系較遠。從江田魚具有相對獨立的地理分布區域和特定養殖模式等特點，受到一定程度自然選擇或人工選擇壓力，但未經系統選育實踐，尚保留較高遺傳多樣性水平，具有進一步選育的潛力。