南四湖人工濕地沉積物中氨氧化細菌的篩選和鑒定

張念鑫,孔 勇,于君君,舒鳳月,周 晶*,王慶峰,于國紅

(1 曲阜師范大學生命科學學院,曲阜 273165;2 上海市農業科學院,上海 201403;3河北省農林科學院旱作農業研究所,衡水 053000)

濕地是陸生生態系統和水生生態系統的過度地帶,是具有保護生物多樣性、改善水質等功能的重要生態系統。 近年來由于人們對濕地生態系統的過度污染,造成了濕地面積銳減等嚴重的環境問題[1]。 作為中國南水北調東線工程重要輸水通道的南四湖,其濕地生態系統的水質良好是確保南四湖水質安全及調水工程順利實施的重要保證。 為了提高南四湖水質、恢復濕地生物多樣性,南四湖流域開展了大規模的濕地修復工程,人工濕地的修建促進了水體凈化和物質循環,其中氮元素的循環過程受到特別關注[2]。

氮素循環是生物地球化學循環中的重要環節之一,其循環過程主要包括固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用4 個過程,均由微生物驅動[3]。 硝化作用是固氮作用和反硝化作用之間的重要環節[4],進一步分為兩個關鍵過程:第一階段的氨氧化過程和第二階段的硝化過程,其中氨氧化細菌參與的氨氧化反應是硝化反應的限速步驟。 自1890 年,Winogradsky 首次發現細菌的氨氧化作用以來,研究者對氨氧化細菌的作用機理和分離純化方式十分關注。 氨氧化細菌的氨氧化作用包括2 個氧化過程[5],分別利用自身的氨單加氧酶(Ammonia Mono Oxygenase,AMO)和羥胺氧化酶(Hydroxylamine Oxidoreductase,HAO)進行反應[6],最終將氨氧化為亞硝酸鹽。 氨氧化細菌屬于革蘭氏陰性專性化能自養細菌,由于其自身的依附性以及生長速率慢等特性,使得從環境中分離純化氨氧化菌成為一大難題。 如今,最常用的方法是先將樣品通過富集培養,再利用硅膠培養基和瓊脂培養基分離純化氨氧化菌。

目前,關于南四湖人工濕地微生物的研究相對較少,而對于氨氧化菌的研究更是微乎其微。 氨氧化細菌作為污水生物處理系統實現氨氮去除的主體,其種群結構組成和種群數量在一定程度上決定了南四湖水體中氮素的循環速率,進一步決定了南四湖水體的富營養程度。 本研究通過從南四湖人工濕地沉積物中分離出具有氨氮去除能力的細菌,以了解南四湖水質的現狀,并為污染水體的生物修復提供初步候選菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

富集培養基(SM):(NH4)2SO42.5 g,KH2PO40.35 g,MgSO4·7H2O 0.25 g,CaCl20.18 g,蒸餾水500 mL,pH 8.0。

分離培養基(BTB 培養基):(NH4)2SO42 g,K2HPO40.75 g,NaH2PO40.25 g,MgSO4·7H2O 0.03 g,MnSO4·4H2O 0.01 g,CaCO35 g,蒸餾水 1 L,pH 7.2。

營養補充液:(NH4)2SO45.5 g,蒸餾水100 mL。

硅膠分離培養基:在155 mL 蒸餾水中加入5.5 mL 相對密度為1.84 的濃硫酸,在185 mL 蒸餾水中加入22 mL 相對密度為1.19 的濃鹽酸,兩者混合即為稀酸液。 在500 mL 蒸餾水中加入82.59 g 硅酸鈉,攪拌溶解即為水玻璃。 提取12 mL 水玻璃和8 mL 稀酸液于燒杯中,快速攪拌至均勻后,倒入培養皿中,靜置60 min 凝固。 凝固后用蒸餾水輕輕沖洗5—8 次,每次15—25 min。 用1%的硝酸銀溶液檢查氯離子的去除效果,若呈白色則繼續沖洗。 當氯離子除去后,用無菌水將硅膠平板沖洗1 次,倒置曬干[7]。 在硅膠平板表面加入2 mL 氨氧化菌分離培養液,然后放入烘箱中,35—45 ℃維持1.0—1.5 h 至表面無液體流動,然后與培養皿蓋一同在紫外燈下照射30 min,即為用于分離氨氧化細菌的硅膠平板。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

南四湖是微山湖、昭陽湖、獨山湖、南陽湖的總稱,為淮河流域第二大淡水湖。 其中微山湖面積最大,故又統稱為微山湖。 湖泊北高南低,南北長約125 km,東西寬5.6—30 km,湖區面積1 225 km2,儲水量19.3 億m3。 隨著人為活動的影響,導致南四湖生態環境惡化,富營養化和沼澤化狀況嚴重。 2005 年3 月,位于南四湖新薛河的人工濕地示范區建設工程正式啟動,使得南四湖的水質得到很大程度的改善。本研究采樣地點位于山東省南四湖新薛河人工濕地,該地為暖溫帶、半濕潤季風氣候,年平均氣溫14.2 ℃,年降水量700 mm。 于2015 年9 月底采集薛河濕地滯留塘底泥,釆用“之”字形布點取樣(圖1),取樣深度均為0—20 cm。 使用取泥器取同樣深度的土樣9 份,充分混合均勻后放入無菌袋中,每處理取4 個重復,封裝后帶回實驗室,4 ℃冰箱保存。

圖1 采樣點Fig.1 Schematic diagram of sampling points

1.2.2 好氧氨氧化菌的分離篩選

將采集的底泥以每10 mL 添加1 g 底泥的比例加入富集培養基中,置28 ℃恒溫室中培養10—15 d。用格利斯試劑在白瓷板上檢測亞硝酸的生成情況[8]。 格利斯試劑檢驗為紅色的富集液中加入1 mL 營養補充液,繼續恒溫培養。 再次檢驗,當檢驗結果呈現深紅色時,吸取1 mL 富集液移至新鮮培養液中恒溫培養。 連續2 次營養補充和移液富集后,吸取0.05 mL 富集液于硅膠平板上28 ℃培養2—4 周,挑取針尖大小的單菌落于瓊脂平板上劃線分離,在28 ℃恒溫室中培養。 重復劃線分離,純化細菌。

1.2.3 16S rDNA 序列擴增

采用愛思進生物科技有限公司AxyPrep 細菌基因組DNA 小量制備試劑盒抽提細菌基因組DNA,并用DNA 純化試劑盒純化DNA 樣品。 以純化后的DNA 為模板進行16S rDNA 靶標基因的擴增,引物采用通用引物 27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (Escherichia coli對應位置為 8—27) 和 1541R:5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。 PCR 擴增程序:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min 40 s,33 個循環;72 ℃ 8 min。 PCR 擴增后的產物,電泳檢測片段大小合格后,進行切膠回收,用天根生化公司的DNA 純化回收試劑盒對擴增產物進行純化。 將純化產物送上海生工生物科技有限公司測序。 將測序后的序列導入NCBI 數據庫,進行比對,尋找親緣關系相近的菌種,并用MEGA 6.1 軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 菌株形態特征

對底泥經過2 次的富集培養后,通過純化分離獲得5 株氨氧化細菌。 在培養過程中發現該細菌能在氨氧化菌富集培養基和瓊脂平板上生長,表明菌株的營養來源方式多樣,適應能力強。 在瓊脂平板上,菌落呈半透明淺灰白色,表面濕潤光滑,微隆起,邊緣整齊(圖2)。 經革蘭氏染色后,置油鏡下觀察,5 株菌均呈現出紅色,均為革蘭氏陰性菌。

圖2 各菌株的菌落形態Fig.2 Colony morphology pictures of each strain

2.2 16S rDNA 序列的系統進化樹構建

通過NCBI 的Bastln 檢索系統進行基因序列同源性分析,16S rDNA 序列同源性比對結果(圖3)發現,篩選分離出的5 株菌中,分別與異氧硝化菌(3 號和11 號)、嗜酸菌(5 號)、酯香微桿菌(4 號和12 號)親緣關系較近。 進化樹分析發現,分離篩選出的異氧硝化菌(3 號和 11 號) 與亞硝基滯氮桿菌(Diaphorobacter nitroreducens)、多羥基丁酸正交桿菌(Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans)和風濕桿菌(Diaphorobacter oryzae)聚為一簇,進一步與亞硝基滯氮桿菌(Diaphorobacter nitroreducens)、多羥基丁酸正交桿菌(Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans)聚為一小簇。 說明3 號和11 號菌株都與Diaphorobacter屬細菌的親緣關系最近。 該屬的細菌對含苯環的物質具有一定的降解作用,且具有一定的絮凝作用,有較強的環境和工業應用價值。 異養硝化-好氧反硝化作用是Diaphorobacter 屬的主要脫氮形式,將硝氮、亞硝氮、氨氮轉化并加以利用進行菌體生長,可促進污染水體的氮循環[9]。 酯香微桿菌(4 號和11 號)與蘇氏微桿菌(Microbacterium suwonense)、酮側體微桿菌(Microbacterium ketosireducens)、解阿拉伯半乳聚糖微桿菌(Microbacterium arabinogalactanolyticum)聚為一簇,其中與解阿拉伯半乳聚糖微桿菌(Microbacterium arabinogalactanolyticum)的進化關系最為接近。 說明4 號和12 號與Microbacterium屬具有高度相似性,此屬細菌常發現于乳制品、污水和昆蟲等。Microbacterium在自然界中廣泛存在,具有極強抗逆性,是修復環境污染的理想微生物。 可修復受油污染的地表水、脫除有機硫,以及降解有機污染物[10]。 嗜酸菌(5 號)與纈草酸卵菌(Acidovorax valerianellae)、西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli) 和沃氏食酸菌(Acidovorax wautersii)聚為一簇,說明5 號與Acidovorax 屬細菌具有高度的相似性,該屬細菌屬于好氧或兼性厭氧非發酵革蘭氏陰性桿菌。 嗜酸菌是極端環境微生物的主要類群之一,生長在酸性環境,這是由于硫或硫化物的存在及氧化,嗜酸菌在地球物質循環方面做出了重要貢獻[11]。 可以看出,整個進化樹將嗜酸菌屬(Acidovoraxsp.)、微桿菌屬(Microbacteriumsp.)、Diaphorobacter 屬分為 3 簇。

圖3 16S rDNA 序列的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences

3 結論與討論

近幾十年來,以無機或有機物作為氮源的異養硝化微生物(包括細菌、放線菌、真菌)相繼在土壤、污泥、湖水、深海火山口等處被發現和分離[9]。 和大多數自養硝化細菌相比,異養型硝化菌生長速率快、細胞產量高并且能忍受酸性較強的環境,雖然至今對異氧硝化菌的代謝途徑不甚了解,但其仍具有一定的硝化性能。 異氧硝化菌能夠利用有機碳生長,并將含氮化合物硝化成亞硝酸鹽、硝酸鹽等產物[10],在人工濕地的氮循環過程中十分重要。

通過對5 株菌的16S rDNA 序列和進化樹分析發現,3 號與11 號屬于Diaphorobacter屬,該菌屬在對數生長期菌體增長迅速的同時去除氨氮的效率增高。 在氨氮濃度較低時菌體生長會進入穩定期,在菌體生長過程中會檢測到少量的硝氮和亞硝氮這是由于菌體發生了異養硝化,但在氨氮濃度偏低時會將這些副產物消耗掉。 而且Diaphorobacter屬細菌在脫氮促進氮素循環的同時,還可降解苯酚類有機物,苯酚對人體和動植物均有毒害作用。 因此,3 號和11 號可作為較好的候選生物修復菌株。

本研究主要是為了篩選具有氨氮去除能力的細菌,用于促進人工濕地污水凈化中的氮素循環。 人工濕地是指將污水有控制的投配到經人工建造的濕地上,污水在沿一定方向流動的過程中,通過土壤、植物、微生物、人工基質等作用,對其自身進行一定程度的凈化技術[12]。 在污水被凈化的過程中,氮元素的去除主要通過氨化、硝化、反硝化、植物吸收和基質吸附等途徑[13]。 南四湖在南水北調東線建設中具有重要地位,其水質對南水北調的整體質量影響較大[14]。 在5 株氨氧化菌的篩選培養過程中,本研究選用氨氧化菌富集培養基和瓊脂平板對其進行分離純化,結果表明5 株氨氧化菌均能夠利用無機氮和有機氮進行生長,其營養來源多樣,能夠適應南四湖人工濕地的復雜環境,促進氮素循環凈化水質。