不同鈉鹽對雙孢蘑菇菌絲生長及工廠化生產產量的影響

肖婷婷,王 倩,雋加香,陳明杰,陳 輝,張津京,宋曉霞,黃建春

(上海市農業科學院食用菌研究所,農業部南方食用菌資源利用重點實驗室,國家食用菌工程技術研究中心,國家食用菌加工技術研發分中心,上海市農業遺傳育種重點開放實驗室,上海 201403)

雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)屬草腐菌類食用菌,不僅味道鮮美,營養價值豐富,還具有很好的保健和藥用效果。 我國雙孢蘑菇工廠化栽培規模不斷擴大,促進了產業的高速發展。 目前,江蘇裕灌現代農業科技有限公司、天水眾興菌業科技股份有限公司及上海聯中食用菌專業合作社等企業引進了荷蘭雙孢蘑菇工廠化培養料三次發酵技術,產量達到30 kg∕m2左右,一個生產周期約80 d,一年可栽培8—10 茬,實現了高度專業化、高效化、周年化生產[1]。 2020 年上海市雙孢蘑菇工廠化產量達到10 158 t,相比于2019年增加了58%,僅次于金針菇和真姬菇。

雙孢蘑菇三次發酵技術是將二次發酵制備的選擇性培養料混合雙孢蘑菇菌種后送入封閉式低壓隧道中,通過自動控制空氣溫度、培養料溫度、氧氣濃度、風速等參數進行菌絲體的繁殖[2]。 在發酵過程中,培養料損失大量能量,且隨著采摘潮次的增加培養料養分進一步流失,極大限制了雙孢蘑菇的產量。 添加劑的使用能及時補充雙孢蘑菇生長后期所需的養分,從而實現增產的目的。 歐美國家雙孢蘑菇工廠化生產中,在播種或覆土階段添加輔料已比較普遍,并且已成為提高雙孢蘑菇產量的一個重要技術手段。添加的形式包括加入額外的蛋白質、碳水化合物、油或者脂質以及礦物質和微量元素[3-6],如Mami 等[7]在雙孢蘑菇覆土中添加適量的圓整豆粒和玉米粒,提高了雙孢蘑菇的產量、子實體數量、干物質含量、總可溶性固形物含量等。 我國雙孢蘑菇工廠化生產較少專注于添加劑的使用及其營養成分的研究,雙孢蘑菇發菌料中添加劑的商業化產品也非常缺乏。

雙孢蘑菇的菌絲生長速度直接影響到栽培周期的長短,從而影響菇房的使用效率及工廠化生產的經濟效益。 菌絲生物量的積累是雙孢蘑菇子實體形成和生長的基礎,探究雙孢蘑菇的營養生殖特性,對提高雙孢蘑菇的產量具有積極意義。 醋酸鈉、檸檬酸鈉水解顯堿性,常用作生長調節劑類添加物。 前人研究發現,在合成麥芽提取物培養基上添加0.1 g∕L 醋酸鈉可以增強雙孢蘑菇子實體的分化能力[8]。 此外,醋酸鈉、檸檬酸鈉還可以提高草菇菌絲生長速度、生物量、產量及生物學效率[9]。 鑒于此,本研究采用一定濃度的醋酸鈉、檸檬酸鈉溶液處理雙孢蘑菇A15 菌株,探究雙孢蘑菇的菌絲生長速度、生物量積累及產量的變化,以期將研究結果應用到工廠化生產中,為雙孢蘑菇添加劑商品化產品研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

雙孢蘑菇A15 菌株的栽培種由美國施爾豐菌種公司提供。 雙孢蘑菇三次發酵料及覆土由上海聯中食用菌專業合作社提供。 醋酸鈉和檸檬酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司。 PDA 培養基為常規的馬鈴薯葡萄糖培養基。

1.2 方法

雙孢蘑菇A15 菌株斜面活化后,接種于PDA 平皿上,25 ℃培養10 d,待菌絲長滿平板后用于接種。將醋酸鈉、檸檬酸鈉作為生長調節劑,設計單因素實驗,PDA 培養測定雙孢蘑菇菌絲生長速度,液體培養測定菌絲生物量。 栽培試驗地點為上海聯中食用菌專業合作社(上海市農業科學院雙孢蘑菇種植基地),分別在三次料和覆土后噴施不同濃度的醋酸鈉或檸檬酸鈉。

1.2.1 菌絲生長速度測定

在 1 L 培養基中分別加入 0.5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g、2.5 g、5.0 g 檸檬酸鈉粉末(或 0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.7 g 醋酸鈉粉末),于121 ℃條件下滅菌20 min后倒入一次性平皿中備用。 選用同一生長狀況的菌絲進行接種,在長滿菌絲的PDA 固體培養基上,取直徑為5 mm 的菌塊接種于不同濃度的醋酸鈉、檸檬酸鈉培養基上,置于25 ℃條件下暗培養,用游標卡尺測定10—13 d 菌落半徑,菌落半徑差值(mm)與生長天數(d)比值即為菌絲生長速度(mm∕d)。 每處理4 個重復,以培養基中不添加任何試劑的處理為對照(CK)。

1.2.2 菌絲生物量測定

在 PDA 液體培養基中分別加入 0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.7 g 醋酸鈉或檸檬酸鈉粉末,分裝于250 mL 錐形瓶內,每瓶100 mL,每處理3 個重復,以培養基中不添加任何試劑的處理為對照(CK)。 取活化后的A15 菌種菌落外圍1 cm 寬的菌絲塊放入均質儀中,加入100 mL 無菌水,打碎10 s,取1 mL 菌液接入250 mL 錐形瓶中,150 r∕min、25 ℃黑暗條件下培養17 d 時,菌絲處于生長旺盛階段,第17 天時收集菌絲。 用烘干至恒重(M1)的濾紙過濾,菌絲團同濾紙共同烘干至恒重(M2),計算菌絲團干重M= M2-M1。

1.2.3 栽培試驗

1.2.3.1 噴施三次料處理

試驗塑料栽培筐面積為 0.1 m2。 配制質量濃度為 0.1 g∕L、0.5 g∕L、1.0 g∕L、1.5 g∕L、2.0 g∕L、2.5 g∕L的醋酸鈉和檸檬酸鈉溶液。 每筐稱取5 kg 三次發菌料,噴施50 mL 各處理溶液,將兩者充分混勻、壓實,再將3.5 kg 東北泥炭土及50 g 三次發菌料攪拌均勻進行覆土,隨機排列于菇房床架上,每處理4 個重復。以筐中不噴施任何溶液的處理為對照1,以噴施同樣量的清水處理為對照。 若對照1 與對照無顯著差異,表明雙孢蘑菇的發菌料經溶液噴施對產量無顯著影響。 菌絲恢復階段通過控制菇房空氣溫度與回風速率使料溫維持在25 ℃左右,CO2濃度在11.8 g∕m3以上,空氣濕度98%—100%,對培養料連續補水4—5 d 共計用量20—22 L∕m2。 進料第7 天降溫并降低 CO2濃度,催蕾,出菇期間空氣溫度為17—18 ℃,濕度為83%—87%,CO2濃度2.4—2.9 g∕m3,風機轉速設置為 50—60 次∕s。 第 20—24 天采摘第一潮菇,采摘后將床架表面殘留的菇腳清理干凈,對床架表面進行補水,進入轉潮期,7 d 后采摘第二潮菇,采摘后清理、補水,再次進入轉潮期,7 d 后采摘第三潮菇,記錄各處理每潮菇的產量。

1.2.3.2 噴施覆土處理

菇房上料的同時進行覆土。 配制質量濃度為0.1 g∕L、1.0 g∕L 的醋酸鈉和檸檬酸鈉溶液。 每個處理選取1 m×1.35 m 的培養料床面,等分成4 個小區,分別在打水期(3 次)、菇蕾期(1 次)、第一潮結束期(2 次)、第二潮結束期(2 次)共9 次對覆土表面噴施各處理溶液500 mL(用量需到達培養料層)。 以噴施同樣量的清水為對照。 雙孢蘑菇的降溫、催蕾、出菇和轉潮等菇房管理同1.2.3.1。 記錄各處理每潮菇的產量。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0 軟件進行Duncan 多重比較,P＜0.05 表示具有顯著差異統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉對雙孢蘑菇菌絲生長和生物量的影響

2.1.1 對菌絲生長速度的影響

雙孢蘑菇A15 菌株在PDA 培養基上生長情況見圖1,其中0.5 g∕L 檸檬酸鈉處理的菌絲潔白粗壯、生長快,菌落濃密。 如圖2 所示,不同質量濃度檸檬酸鈉處理的雙孢蘑菇菌絲生長速度依次為0.5 g∕L ＞1.0 g∕L ＞1.5 g∕L ＞ CK ＞ 2.0 g∕L。 隨著檸檬酸鈉濃度的升高,菌絲生長速度逐漸降低,當質量濃度為2.0 g∕L 時,雙孢蘑菇菌絲生長受到了明顯抑制。 可見,培養基中添加適當質量濃度(0.5 g∕L)的檸檬酸鈉能夠促進菌絲生長,濃度過高則會抑制其生長。

圖1 不同濃度檸檬酸鈉培養基上雙孢蘑菇的菌落形態Fig.1 Colony morphology of A.bisporus on sodium citrate medium with different concentrations

圖2 不同濃度檸檬酸鈉處理對雙孢蘑菇菌絲生長速度的影響Fig.2 Effects of different concentrations of sodium citrate on mycelial growth rate of A.bisporus

如圖3—4 所示,0.1 g∕L 和0.2 g∕L 醋酸鈉處理的雙孢蘑菇菌絲生長速度快、分枝多且密,長勢好。隨著醋酸鈉濃度繼續升高,菌絲生長速度逐漸降低,當質量濃度為0.7 g∕L 時,雙孢蘑菇生長速度最慢。試驗表明,0.2 g∕L 醋酸鈉處理能夠較好地促進雙孢蘑菇菌絲生長。

圖3 不同濃度醋酸鈉培養基上雙孢蘑菇的菌落形態Fig.3 Colony morphology of A.bisporus on sodium acetate medium with different concentrations

圖4 不同濃度醋酸鈉處理對雙孢蘑菇菌絲生長速度的影響Fig.4 Effects of different concentrations of sodium acetate on mycelial growth rate of A.bisporus

2.1.2 對菌絲生物量的影響

如圖5 所示,當檸檬酸鈉質量濃度為0.2 g∕L 時,雙孢蘑菇菌絲生物量最高,是CK 的2.6 倍,存在顯著差異。 當醋酸鈉質量濃度為0.1 g∕L 與0.5 g∕L 時,雙孢蘑菇菌絲生物量最高,與CK 存在顯著差異,但達到 0.7 g∕L 時,菌絲生長出現了明顯的抑制現象。 綜上,0.2 g∕L 檸檬酸鈉、0.1 g∕L 和 0.5 g∕L 醋酸鈉處理可以提高雙孢蘑菇菌絲生物量的積累。

圖5 不同濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉處理對雙孢蘑菇菌絲生物量的影響Fig.5 Effects of different concentrations of sodium citrate and sodium acetate on mycelial biomass of A.bisporus

2.2 培養料中施用不同濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉對雙孢蘑菇產量影響

在上述檸檬酸鈉處理得到菌絲生長最快質量濃度(0.5 g∕L)、生物量最高質量濃度(0.2 g∕L)的基礎上,設計檸檬酸鈉濃度的栽培試驗,即在雙孢蘑菇三次培養料中噴施不同濃度的檸檬酸鈉處理觀察產量變化。噴施清水與不噴施清水處理的產量無明顯差異,說明清水對雙孢蘑菇產量不會造成影響(圖6—8)。 雙孢蘑菇三潮總產量統計表明:0.5 g∕L、1.0 g∕L 檸檬酸鈉處理的雙孢蘑菇產量高于CK,分別提高了12.7%、6.4%;其中0.5 g∕L 檸檬酸鈉處理蘑菇產量最高,主要表現在第一潮及第三潮產量高于CK(圖8)。 醋酸鈉不同濃度栽培試驗結果顯示,在雙孢蘑菇三次培養料中噴施不同濃度的醋酸鈉對雙孢蘑菇產量無明顯影響(圖8),可能是雙孢蘑菇菌絲恢復階段補水過多,導致培養料積水腐爛,使D 處理產量降低。

圖6 不同濃度檸檬酸鈉噴施三次料的雙孢蘑菇出菇情況Fig.6 Fruiting situation of A.bisporus sprayed three-time cultivation material with different concentrations of sodium citrate

圖8 不同濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉噴施三次料對雙孢蘑菇產量的影響Fig.8 Effects of spraying three-time cultivation material with different concentrations of sodium citrate and sodium acetate on the yield of A.bisporus

圖7 不同濃度醋酸鈉噴施三次料的雙孢蘑菇出菇情況Fig.7 Fruiting situation of A.bisporus sprayed three-time cultivation material with different concentrations of sodium acetate

2.3 覆土上噴施高、低濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉對雙孢蘑菇產量影響

將鈉鹽進行生產應用,培養料栽培面積從0.1 m2擴大到1.35 m2,借鑒上述得到的鈉鹽促進菌絲生長、提高產量的最適濃度開展試驗。 在雙孢蘑菇覆土后的表面噴施不同濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉溶液處理,觀察出菇情況(圖9)。 40 d 后統計雙孢蘑菇產量,結果表明:不同濃度的檸檬酸鈉處理均可提高雙孢蘑菇產量,且在第一潮較明顯;噴施0.1 g∕L、1.0 g∕L 檸檬酸鈉使雙孢蘑菇產量分別提高了19.8%、21.6%(圖10)。 醋酸鈉處理結果顯示,0.1 g∕L 醋酸鈉處理使雙孢蘑菇產量提高了17.4%,主要提高了第一潮菇產量,而1.0 g∕L 醋酸鈉處理對產量無明顯影響。

圖9 不同濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉噴施覆土的雙孢蘑菇出菇情況Fig.9 Fruiting situation of A.bisporus sprayed covering soil with different concentrations of sodium citrate and sodium acetate

圖10 覆土后噴施不同濃度檸檬酸鈉和醋酸鈉處理對雙孢蘑菇產量的影響Fig.10 Effects of spraying different concentrations of sodium citrate and sodium acetate after covering soil on the yield of A.bisporus

3 結論與討論

本研究表明,在培養條件和接種條件一致的情況下,一定濃度的醋酸鈉或檸檬酸鈉處理對雙孢蘑菇菌絲生長及產量有較明顯的影響。 其中,0.1 g∕L 醋酸鈉處理對雙孢蘑菇菌絲生長及生物量有促進作用,覆土上噴施相同濃度溶液使雙孢蘑菇產量提高了17.4%,而培養料中噴施效果不明顯。 0.5 g∕L 檸檬酸鈉處理可提高雙孢蘑菇菌絲生長速度及生物量積累,噴施培養料使產量提高了12.7%;覆土后噴施0.1 g∕L、1.0 g∕L 檸檬酸鈉使產量分別提高了 19.8% 、21.6% 。

侯立娟等[10]研究表明,0.7 g∕L 醋酸鈉或檸檬酸鈉處理可顯著增加草菇液體培養菌絲生物量,從而有助于提高草菇產量,原因可能是添加醋酸鈉后使培養基質的pH 更有利于草菇菌絲的生長。 本研究表明,隨著醋酸鈉或檸檬酸鈉處理濃度的升高,pH 會穩定在一定范圍內,可能是醋酸鈉、檸檬酸鈉水解釋放堿性離子,起到了很好的緩沖作用,栽培生產中可避免因培養料pH 下降不利于蘑菇生長的情況。

本研究中,0.5 g∕L 檸檬酸鈉處理可以加快雙孢蘑菇菌絲生長速率、提高菌絲生物量,與林金盛等[9]研究結果相似。 吳風雅等[11]研究表明,使用10 g∕L 醋酸溶液在雙孢蘑菇第三潮后每潮間期噴灑一次,有利于增補營養或促進覆土中微生物系適度發展,進而促進雙孢蘑菇發育,可普遍增產10%左右。 本研究采用0.1 g∕L 醋酸鈉溶液在雙孢蘑菇覆土后每潮間期噴施,可增產17.4%,最適濃度產生差異的原因可能是醋酸鈉噴施的階段不同。 此外,Hou 等[12]在“噴重水期”(播種后5 d)用0.2 g∕L 醋酸鈉處理草菇栽培基質,有一定的增產效果,可能是草菇產生多種胞外酶,將大分子營養物質逐步降解為可溶并易于吸收利用的小分子糖類物質,為草菇營養生長、菌絲分化、原基形成提供養分。 本研究結果與之相似,同屬草腐菌的雙孢蘑菇覆土后噴施0.1 g∕L 醋酸鈉,產量提高了17.4%。

利用本研究得到的醋酸鈉、檸檬酸鈉溶液可以提高雙孢蘑菇產量的結果結合蘑菇生長所需的碳源、氮源及微量元素等配制成添加劑產品,有助于解決工廠化生產中因培養料養分消耗限制蘑菇產量的問題。 醋酸鈉、檸檬酸鈉使草腐菌增產的原因可能是補充了微量元素,或提供了菌絲生長利用的能量物質,亦或是增加了代謝通路中重要基因的表達,如改變相關酶的調控活力等。 對于醋酸鈉、檸檬酸鈉提高雙孢蘑菇產量作用的分子機理及相關添加劑產品有待進一步探究。