PEG 滲透脅迫條件下26 份花生品種萌發期抗旱性評價

楊秀麗,寧東賢,趙玉坤,楊麗萍,李 楠

(山西農業大學小麥研究所,臨汾 041000)

我國是世界上最干旱的國家之一,干旱半干旱面積占國土面積的52.5%,干旱缺水是我國農業生產面臨的嚴重問題,干旱脅迫給農作物帶來的損失遠大于其他所有逆境損失的總和[1]。 花生(Arachis hypogaeaL.)是較耐旱耐貧瘠的油料和經濟作物之一,也是發展旱作農業、充分開發利用旱薄地資源的理想大田作物。 在國內農作物中,花生種植業年產值已超過1 000 億元人民幣,居第4 位,排在玉米、水稻、小麥之后,與大宗糧油作物相比,花生初級產品價格較高,單位面積收益率高,可給農民帶來更多的經濟效益[2]。 然而,干旱依然成為花生生產上危害程度較大的逆境因素之一,可引起花生品質下降,種子發芽率降低,病蟲害增加等,最終導致嚴重減產,所以,挖掘抗旱性強的花生種質成為經濟有效且重要的抗旱措施。

種子萌發期是作物生長中對逆境反應最為敏感的階段之一,萌發優劣態勢極大影響作物后期群體的構建,因此,研究干旱條件下花生種子萌發受到的影響對于篩選耐旱花生種質具有重要意義。 關于不同作物種子萌發期的抗旱性研究已見諸多報道,且認為種子發芽率、發芽勢、發芽指數和根長等與抗旱性密切相關[3-7]。 聚乙二醇(PEG)模擬干旱脅迫的方法具有操作簡單、周期短、效率高且重復性好等優勢,被廣泛應用于作物早期抗旱種質資源篩選與鑒定中[8]。 張智猛等[9]利用此法研究花生品種芽期的抗旱性,發現根長、生根率和根干重與品種抗旱能力呈顯著相關,且證實了17.5% PEG-6000 處理下,花生萌發期品種間差異最大,該濃度下宜進行干旱脅迫試驗。 大量研究已經證實,作物在遭遇干旱脅迫時,其理化性質會發生變化,細胞內產生大量自由基,破壞作物體內活性氧代謝平衡,膜脂過氧化終產物丙二醛(MDA)含量增多,同時,作物體內超氧化物歧化酶(SOD)會清除這些自由基,減少生物膜系統的損傷,因此,干旱脅迫下,作物體內MDA 含量和SOD 活性的變化與作物抗旱性之間具有相關性。 本研究利用17.5%的PEG-6000 脅迫液模擬干旱逆境,采用隸屬函數法對26 個農藝性狀表現優良的花生品種種子萌發期抗旱性進行綜合研究與評價,并對兩個不同類群花生品種的生理差異進行分析,旨在進一步豐富花生抗旱育種種質。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

26 份花生試驗材料均由山西農業大學小麥研究所花生課題組提供,具體見表1。 所有材料于2019 年10 月花生種質資源圃中獲得。

表1 花生種質及來源Table 1 Peanut germplasm and source

1.2 試驗設計

1.2.1 種子處理與培養方法

剝殼取出花生種仁,每份種質挑選成熟飽滿、大小一致的種子,用75%的酒精消毒后,蒸餾水沖洗干凈并將其浸泡12 h,取出種皮完整的種子,用濾紙吸干種子表面水分,擺放在直徑150 mm、底部墊有2 層濾紙的培養皿中,每皿20 粒,加入30 mL 17.5%的PEG-6000 脅迫溶液,對照(CK)以等量蒸餾水代替,重復3 次,置于(28 ±1)℃暗培養箱中。 以放入培養箱時間為調查首日,以后固定時間觀察并記錄發芽情況,每日更換濾紙,并加入脅迫溶液,保證脅迫強度的穩定性[9-10]。

1.2.2 花生苗培養方法

每個品種挑選大小一致、完整飽滿的種子,用75%酒精消毒10 min 后,純水沖凈表面殘留乙醇,再用純水浸泡12 h,置于墊有濾紙的培養盒中,在人工氣候箱中(28 ±1)℃恒溫暗培養5 d。 選取子葉展開較好且長勢一致的材料移入裝有Hoagland 營養液的水培盒中,每個水培盒栽種8 棵苗,每個品種移栽6 盒,3 盒做干旱脅迫處理,3 盒做對照處理,全部置于光照培養箱中,設置光暗周期16 h∕8 h,晝夜溫度26 ℃∕15 ℃,第一片真葉展開時,用17.5%PEG-6000 的Hoagland 營養液做苗期脅迫處理,期間控制脅迫濃度,脅迫處理3 d 后,每兩天定時摘取葉片1 次,用液氮速凍,置于-80 ℃冰箱中保存待測,連續摘取6 次。

1.2.3 指標測定與方法

胚芽突破種皮,露出3 mm 的白色芽尖為種子發芽標準。 將第1 粒種子發芽之日定為該處理發芽的開始期,以后每隔1 d 定時記錄發芽種子數,當連續3 d 不再有種子發芽時作為發芽試驗結束期,挑選10粒發育正常的種子,測定其胚軸長和主根長,胚根伸長長度即胚軸和主根的總長度。 計算發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數、根軸比和根長脅迫指數[11-13]。 各指標計算公式如下:

1.2.4 SOD 活性和 MDA 含量測定

取0.5 g 葉片,放入冰浴的研缽中,分次加入5 mL 的pH 7.8 的磷酸緩沖液(含1%PVP 和0.2 mmol∕L EDTA),研磨,取勻漿至離心管中,12 000 r∕min 離心30 min,移出上清液,用于 SOD 和MDA 含量分析。SOD 活性測定采用氮藍四唑(NBT)還原法,MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸比色法。

1.3 數據處理與抗旱性評價方法

采用Excel 2010 進行數據整理,利用SPSS 24.0 進行統計學分析。 采用隸屬函數方法對各抗旱性指標進行綜合評價[14]。 隸屬函數值公式為:μ(xj)=(xj-xmin)∕(xmax-xmin) ,j=(1,2,3,…,n)。 式中,μ(xj)為各品種第j個性狀的隸屬函數值,xj為各品種某一指標性狀的相對值(各指標性狀相對值=干旱脅迫下性狀測定值∕對照處理下性狀測定值),xmax和xmin分別為所有參試品種中第j個指標性狀相對值的最大值和最小值。 采用標準差系數法確定指標的權重,標準差系數Pj用公式(1)計算,因子權重系數Wj用公式(2)計算,抗旱性度量值D用公式(3)計算[15-16]。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫條件下測定指標的方差分析

由表2 可知,不同品種的發芽率差異不顯著;CK 和17.5% PEG-6000 處理下的發芽率存在極顯著差異;濃度和品種交互效應下的發芽率存在顯著差異,即不同品種在17.5% PEG-6000 脅迫處理下的反應是不同的。 發芽勢和發芽指數在各品種之間和不同處理下都存在極顯著差異,說明品種和17.5% PEG-6000 脅迫液對花生發芽勢和發芽指數的影響均是極顯著的,發芽勢和發芽指數可以反映各個品種在干旱脅迫處理下的差異性,因此用發芽勢、發芽指數來評價品種的抗旱性是可行的。

表2 不同處理下26 份材料發芽指標的方差分析Table 2 Variance analysis of germination indexes of 26 peanuts under different treatments

2.2 干旱脅迫條件下測定指標的變化

從表3 可見,干旱脅迫使得花生萌發期的生長受到抑制,各指標下降程度大小依次是活力指數＞發芽勢＞發芽率＞發芽指數,干旱脅迫下胚軸生長受較大抑制,長度縮短,根軸比相應增加。 5 個指標在各品種間較對照處理變異系數增長倍數不同,大小依次是發芽勢＞發芽率＞發芽指數＞根軸比＞活力指數,表明26 個品種的抗旱性之間存在差異。

表3 不同處理下花生萌發期各指標的變化情況Table 3 Changes of various indexes during germination period under different treatments

2.3 干旱脅迫條件下抗旱性綜合評價

2.3.1 測定指標的相關分析

從表4 可見,除了相對發芽勢中最大值大于1(1.029)以外,其余4 項指標數值都小于1,說明26 個品種的這些性狀在干旱脅迫下均受到抑制,但各指標間的變異程度存在差異,變異系數越大,說明該性狀對干旱脅迫反應越敏感,反之,變異系數越小,該性狀對干旱脅迫越不敏感,各性狀在干旱脅迫下的敏感程度為X4＞X5＞X2＞X3＞X1。

表4 26 個花生品種萌發期指標Table 4 Indexes for germination period of 26 peanuts

從表5 可知,種子萌發期,5 項指標之間均存在顯著或極顯著正相關。 根長脅迫指數(X5)越大,胚根受抑制作用越不明顯,抗旱能力就越強。 相對發芽率(X1)、相對發芽勢(X2)、相對發芽指數(X3)、相對活力指數(X4)均與根長脅迫指數(X5)呈現顯著或極顯著正相關,其中,相對活力指數(X4)和根長脅迫指數(X5)之間相關性最大(相關系數=0.983)。 這5 項指標均可用來評價花生萌發期的抗旱性。

表5 26 個花生品種萌發期測定指標的相關性分析Table 5 Correlation analysis of measuring indexes for germination period of 26 peanuts

2.3.2 花生萌發期抗旱性的綜合評價

運用隸屬函數法,以相對發芽率(X1)、相對發芽勢(X2)、相對發芽指數(X3)、相對活力指數(X4)和根長脅迫指數(X5)5 個指標為依據,對26 個花生品種的萌發期抗旱性進行綜合評價,結果用D值來反映,通常D值越高,表示該品種的抗旱能力越強,反之亦然。 表6 顯示,26 份材料的綜合評價D值變幅范圍為0.119 4—0.973 8,差異較大,‘花育25 號’D值最大,抗旱性最強,‘白珍珠’D值最小,抗旱性最弱。

表6 26 個花生品種抗旱評價指標相對值、隸屬函數值及綜合評價Table 6 Relative value,membership function value and comprehensive evaluation of drought resistance evaluation index for 26 peanut varieties

2.3.3 花生萌發期抗旱性的聚類分析

依據26 份花生供試材料的綜合評價結果,對供試材料進行聚類分析。 在平方歐氏距離為5 處,26 份花生材料分成5 個類群(圖1),第Ⅰ類群包括4 個品種(編號:10、13、25、26),占供試材料總數的 15.4%,D值變幅范圍在0.763 4—0.973 8,平均值為0.883 6,屬于強抗旱型品種;第Ⅱ類群包括 9 個品種(編號:3、5、12、15、16、19、21、22、23),占供試材料總數的34.6%,D值變幅范圍在0.502 4—0.700 4,平均值為0.592 6,屬于較抗旱型品種;第Ⅲ類群包括 5 個品種(編號:1、9、17、18、24),占供試材料的19.2%,D值變幅范圍在0.320 7—0.454 5,平均值為0.413 0,屬于弱抗旱型品種;第Ⅳ類群包括6 個品種(編號:4、6、7、8、11、14),占供試材料總數的 23.1%,D值變幅范圍在0.126 2—0.346 9,平均值為0.215 8,屬于干旱敏感型品種;第Ⅴ類群包括2 個品種(編號:2、20)種,占總試材的7.7%,D值變幅范圍在0.119 4—0.134 2,平均值為0.186 5,屬于干旱高敏感型品種。

圖1 26 份花生品種的萌發期抗旱性綜合評價聚類分析Fig.1 Clustering analysis diagram of 26 peanut varieties on drought-resistance for germination period

2.4 干旱脅迫下花生幼苗SOD 活性變化

選擇第Ⅰ類群的4 個強抗旱性品種和第Ⅴ類群的2 個干旱高敏感性品種進行生理差異性分析。 圖2 顯示,干旱脅迫后12 d 內,6 個花生品種的SOD 活性總體均呈現上升趨勢,尤其在8—12 d 中,‘花育25’(編號10)、‘開農8 號’(編號 13)、‘晉花 8 號’(編號 25)和‘商花6 號’(編號26)的SOD 活性上升幅度明顯高于之前,而‘白珍珠’(編號2)和‘花育23’(編號20)的SOD 活性上升趨勢相較其他品種明顯緩慢;干旱脅迫12 d 之后,‘白珍珠’(編號 2)、‘花育 25 號’(編號 10)和‘商花6 號’(編號26)的SOD 活性呈現緩慢下降趨勢,‘開農8 號’(編號 13)、‘花育 23’(編號 20)和‘晉花8 號’(編號25)的SOD 活性依然有上升的表現,但上升幅度較之前明顯減小。

圖2 不同品種對干旱脅迫反應的SOD 活性變化Fig.2 Changes in SOD activity of different varieties in response to drought stress

從表7 可以看出,隨著干旱脅迫時間增加,各品種間SOD 活性較對照表現出較大的差異。 干旱脅迫4 d,各品種的SOD 活性較對照均有所下降;干旱脅迫6 d,‘花育25 號’和‘晉花8 號’的SOD 活性較對照提高0.6%和4.6%,其余品種仍低于對照;干旱脅迫8 d,除了‘花育23’的SOD 活性略低于對照,其余品種相比對照均有所增加;干旱脅迫10—14 d 內,所有品種SOD 活性較對照均有所增加,但增幅存在差異,總體呈現強抗旱型品種‘開農8 號’、‘晉花8 號’、 ‘花育25 號’和‘商花6 號’的SOD 活性與對照相比增幅明顯,而干旱高敏感型品種‘白珍珠’和‘花育23 號’的增幅相對較小。

表7 干旱脅迫下不同品種SOD 活性變化情況Table 7 Changes of SOD activity of different varieties under drought stress

2.5 干旱脅迫下花生幼苗MDA 動態變化

花生幼苗受到干旱脅迫后,體內的活性氧自由基累積并引發膜脂過氧化反應,丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的主要產物之一。 圖3 顯示,干旱脅迫下,第Ⅰ類群和第Ⅴ類群的6 個品種幼苗期的MDA 含量均呈上升趨勢,而且在干旱脅迫4—10 d 內的MDA 累積速度最快,干旱脅迫10—14 d,除了‘白珍珠’MDA累積速度仍然很快外,其他品種累積速度變得緩慢。 干旱敏感型的2 個品種(‘白珍珠’和‘花育23 號’)MDA 含量整體高于抗旱型強的4 個品種(‘開農8 號’、‘晉花 8 號’、‘花育25 號’和‘商花 6 號’),說明干旱脅迫下,強抗旱型品種的幼苗膜脂過氧化程度小于干旱敏感型品種,可以更快抵御和適應干旱環境。

圖3 不同品種對干旱脅迫反應的MDA 含量變化Fig.3 Changes of MDA content in different varieties in response to drought stress

3 結論與討論

3.1 PEG-6000 干旱脅迫與抗旱鑒定

不同環境逆境對作物生長發育的影響程度不同,其中,作物對干旱逆境的反應最大,而且,作物不同生長階段對干旱脅迫的反應存在差異,相對于其他生長時期,于作物萌發期進行抗旱性鑒定具有耗時短、重復性好、環境影響小等優勢。 前人在小麥、玉米、大豆、綠豆、水稻和番茄等作物的萌發期都進行了抗旱性研究[4,6-7,17-20]。

目前,室內PEG 模擬干旱脅迫法是花生萌發期抗旱性鑒定與評價最常用的方法。 PEG 是一種高分子滲透劑,其濃度達到一定程度時會使植物組織和細胞處于類似干旱脅迫中。 不同作物萌發期抗旱鑒定的適宜脅迫濃度是不同的[19-20],張智猛等[21]發現,17.5%PEG-6000 脅迫條件下不同花生品種間萌發期情況差異最大,是進行干旱脅迫模擬的適宜濃度。 本研究在預備試驗中采用了10% 和20% 的PEG-6000 處理花生種子,發現10%濃度處理下,種子萌發未被抑制,發芽率基本是100%,胚軸和胚根的伸長生長受抑制作用小,較對照差異不明顯,而20% 濃度處理下,絕大多數的種子萌發受到嚴重抑制作用,甚至不萌發,因此,本研究運用17.5% PEG-6000 處理26 份供試材料,結果顯示,此濃度下各品種間不同評價指標值的差異性顯著,可以有效評價品種間抗旱性差異。

3.2 花生抗旱性鑒定指標的綜合評價

不同花生品種對干旱脅迫的響應不同,本研究用不同指標的相對值分析抗旱性差異,減少了品種間固有差異的影響,可以更準確評判品種的抗旱性,另外,指標相對值的比較和分析也更具有科學性[22]。 本試驗依據綜合評價D值,通過聚類分析將26 份材料歸納為5 類群,‘花育25 號’、‘開農8 號’、‘晉花8號’和‘商花 6 號’是強抗旱型品種;‘臨花8 號’、‘花育27 號’、‘963’、‘唐 8252’、‘抗3’、‘8130’、‘山花9 號’、‘開農 69’和‘海高’是較抗旱型品種;‘白沙1016’、‘山花12 號’、‘濰花13 號’、‘豐花1 號’和‘魯花11 號’是弱抗旱型品種;‘魯花14 號’、‘易花 13 號’、‘錦花 10 號’、‘桂花 30’、‘粵油 256’和‘豐花 6號’是干旱敏感性品種;‘白珍珠’和‘花育23 號’是干旱高敏感性品種。 從劃分結果可以看出類群間或類群內的遠近關系,為后續科學合理地對種質資源開展研究和利用奠定基礎。

3.3 干旱脅迫下SOD 活性和MDA 含量的變化

PEG-6000 模擬干旱脅迫逆境初期,花生幼苗葉片的SOD 活性低于對照,隨著脅迫時間推移,SOD 活性逐漸升高,但不同品種間存在差異,強抗旱性的花生品種較對照增幅明顯,而干旱敏感型品種較對照增幅較小;MDA 是植物體內膜脂過氧化的主要產物之一,當花生在干旱脅迫環境下生長時,幼苗體內開始積累,但不同品種的MDA 累積含量隨著脅迫時間的不同存在一定差異,干旱敏感型的2 個品種的MDA 累積含量總體高于其他抗旱型品種,在干旱逆境中,其體內細胞受傷害程度較高,幼苗期生長受到較大影響。 通過在逆境下對花生生理指標進行測定,可以驗證抗旱性綜合評價結果的有效性,同時也可作為花生抗旱性篩選的依據。

花生抗旱性是一個相當復雜的生理生化過程,是受多基因控制且復雜的生物學表現。 花生不同生長發育階段的抗旱性因干旱脅迫程度和持續時間的變化呈現出差異,本試驗從大量試驗材料中快速篩選抗旱性材料,然而鑒定結果無法詮釋其整個生育期的抗旱性,需在其他生育期進一步研究驗證。