SRAP標記的野生油茶種質遺傳多樣性研究

文 張濤 朱孝天 肖立宏 .安徽東旭大別山農業科技有限公司；.安徽農業大學

目的：研究野生油茶種質遺傳的多樣性。方法：選取分辨力較強、多態性較高的19對引物組合，利用相關序列擴增多態性分子標記技術（SPAP）對65份油茶種資源進行遺傳多樣性分析。結果：19對引物共擴增出281條帶，多態性條帶為238條，多態性頻率為84.70%。此外，65份油茶種質資源間的遺傳相似性變化范圍在0.59-0.96之間，在經過聚類分析后發現，當相似系數為0.64時，可以將65份資源分為6個類群。結論：野生油茶種植物種之間具有較為豐富的遺傳多樣性，在油茶育種、保護方面有著十分重要的作用。

山茶科山茶屬的油茶是我國特有的一種食用油本植物，其栽培的歷程較長，大約有兩千年之久。同時，它也是世界上四大木本油料植物之一。此外，這種油茶中含有較多的不飽和脂肪酸，這些都是人體極其需要的物質，這種油茶還有較高的營養價值、保健價值、藥用價值。因此，對這種野生種植油茶的遺傳多樣性研究十分重要。

相關序列擴增多態性是一種基于聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）的新型分子標記技術。對于這種技術而言，其穩定性相對較高，在油茶的SRAP-PCR體系建立與優化中應用較為廣泛，在天然群體、優良無性系的遺傳多樣性、種質資源研究中較為常見。本文利用相關序列擴增多態性分子標記技術（SPAP）對65份野生油茶種質資源進行了分析，旨為充分利用和挖掘油茶種質資源提供參考依據，這對油茶品種的培育和栽培有重要作用。

1 .材料與方法

1.1 供試材料

選取具有代表性的65株野生油茶單株為實驗材料。

1.2 CTAB法提取植物DNA

采用植物DNA的提取方法CTAB法提取油茶中的DNA，并使用稀釋的方式將其稀釋為100ng/μL，保存溫度為-20℃。

1.3 SRAP擴增PCR反應體系

采用PTC-100PCR儀器來進行PCR擴增，并采用25μL反應體系：1.25μL引物（25ng/μL）、1.25μL模板DNA（100ng/μL）、12.5μLMix、ddH2O補足25μL。

反應程序：首先94℃5min繼續94℃1min，35℃1min，72℃1.5min，5個循環，94℃1min，50℃1min，72℃1.5min，循環35次后，72℃延伸7min，在4℃溫度下保存。

1.4 篩選多態性引物組合

在篩選過程中，應選擇擴增條帶相對較好、重復性較高的143對SPAP引物來完成SPAP擴增。

1.5 數據分析

用“1”和“0”分別表示SRAP擴增譜的有和無，并用多態性計算所獲取的數據；采用NTSYS-pc9（Version2.10e）計算相應的遺傳相似系數和遺傳距離；聚類圖的建立要按照非加權平均法（unweighted pairgroup method with arithmetic means，UPGMA）進行建立。

2 .結果與分析

2.1 SRAP擴增分析

在143對引物中篩選出19對SRPA引物進行PCR擴增，篩選的擴增帶需豐富，并且具有較高的清晰度。在進行相應的PCR擴增后，得到相應的擴增帶，詳見表1，并條帶的大小范圍在250-2000bp之間。其中，平均每條引物可以獲得擴增條帶為14.9條，多態性條帶為238條，多態性頻率為84.70%，詳見表2。當引物為E1/M11和E4/M7時，擴增出的多態性條帶為20條，相比較其他引物較多，如圖1所示。當引物為E5/M7時，擴增出的多態性條帶為8條，相比較其他引物較少。經過上述的分析表明：在經過SRAP標記后，其多態性相對較高、清晰度較好，在評價野生油茶種植資源多樣性方面有十分重要的作用。

圖1 以E4/M7為擴增引物的SRAP圖譜

表1 用于野生油茶種質SRAP分析的引物序列

表2 SRAP的引物擴增條帶統計

2.2 遺傳多樣性分析

物種之間的基因變化情況可以通過分析遺傳多樣性指標來確定。為了明確物種的起源以及預測物種的生長趨勢，首先需對物種的遺傳多樣性進行相應的研究，這對物種的保存和培育有重要作用。

本次研究采用19對SRAP引物對65份野生油茶種質資源進行PCR擴增，在經過相應的擴增以后，得到其平均多肽頻率，大約為84.70%。其中，有兩對的多肽頻率相對較高，高達100%。在對E2/M9、E3/M8、E12/M10進行擴增分析后發現，其多肽頻率相對其它物種較低，發生這種情況的原因可能是與提供的材料有關。但是總體來說，SRAP在評價油渣資源的遺傳多樣性方面十分關鍵，其評價的準確性相對較高。對于一些差異相對較大的遺傳多樣性而言，其充分證明了本次研究具有相對較大的遺傳變異性，為油茶資源的收集提供了重要的依據，對后續的油茶資源培育和雜交育種有重要作用。

2.3 65份油茶種質資源遺傳相似性分析

就遺傳相似性而言，其能夠準確的判斷出油茶物種之間的親緣關系。在通過19對引物組合對65份油茶種質資源進行分析以后，發現其遺傳相似性的變化范圍在處于0.59-0.96之間。其中遺傳相似性最高的達到0.96，說明兩種材料之間的親緣關系相對較近，而遺傳相似性最低為0.59，說明兩材料之間的親緣關系相對較遠。

2.4 遺傳聚類分析

經上述研究結果表明：在進行的相應的PCR擴增試驗后，發現野生油茶的遺傳相似性似系數位于0.59-0.96范圍內。其中，在系數為0.64時，可將其分為6各種群。此時，來自同一區域A的野生油茶主要是聚集在Ⅰ類種群中；來自區域B的野生油茶分別集中在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ類種群；C區域的野生油茶集中在Ⅰ、Ⅱ類種群中，區域D的野生油茶集中在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ類種群中。經過相應的研究表明，區域A、B中的野生油茶遺傳多樣性相比較C、D較低，但是卻具有較高的親緣關系。

3 .討論

本次研究選取分辨力較強、多態性較高的19對引物組合，利用相關序列擴增多態性分子標記技術（SPAP）對65份油茶種資源進行擴增。在進行擴增以后，得到的多態性條帶較為豐富，并且清晰度和重復性較高，這充分說明了野生油茶種質資源的遺傳多樣性比較豐富，并且容易育種和進行遺傳改良。在進行聚類分析后，發現野生油茶的遺傳相似性系數在0.59-0.96范圍內，聚類結果充分說明了野生油茶樣品之間存在相應的遺傳差異性。此外，從分析結果中可以看出，當植株屬于同一類群時，植株可能是來源于相同的區域中，也有可能是來自不同區域中，此種結果充分表明了野生油茶聚類分析并沒有考慮到植株的來源地，導致植株的親緣關系具有一定的復雜性。產生這種情況的原因主要有以下幾點：（1）不同植株之間進行授粉、偶然的基因突變、在長期的自然條件下，油茶為了更好的適應環境，因此具有了多樣性的特征；（2）一部分的樣品沒有根據其地理區域進行聚合，這可能是由于油茶自然分化時地理區域的影響小于遺傳漂移數量不均導致聚類結果不夠均勻。

綜上所述，本次研究選取的野生油茶種質資源生產區域氣候比較適合油茶的生長。但是在品種混亂以及粗放式管理的經營模式下，導致野生油茶的收益并不理想。因此，在未來的野生油茶育種和保護的過程中，需充分利用現有的野生油茶資源，并將其收入到資源庫中，使得其選擇基地規模變大。