葉酸基因多態性與胎兒神經管缺陷的研究進展

裴嬌嬌， 黃超林， 謝江燕

(成都醫學院第一附屬醫院婦產科， 四川 成都 610500)

1 概 述

胎兒神經管畸形(neural tube defects,NTDs)是僅次于先天性心臟病的第二種最常見的嚴重出生缺陷，在全世界，每1000例中就有1例NTDs，給家庭和社會帶來了巨大的負擔和壓力。神經管發育開始于妊娠的第3～4周，由中胚層中背側部分神經板的底層脊和前脊索折疊形成，并通過神經元的形成封閉前后神經孔。如果在整個神經發育過程中受到某些致病因素的影響，則會導致NTDs。NTDs可存在于從大腦到脊髓的任何部位，分為開發性神經管畸形和閉合性神經管畸形。NTDs致病的詳細機制仍不清楚，但一致認為是遺傳和環境因素相互作用的結果[1]。

眾所周知，補充葉酸孕婦可以顯著降低NTDs的發病風險，從開始實行葉酸強化，顯著降低了NTDs的發生率[2]。目前建議所有育齡婦女在懷孕前每天服用含有0.4mg葉酸的復合維生素，對于有過患病孩子的婦女來說，建議每天補充4mg葉酸，以減少NTDs的復發風險[3]。但葉酸如何降低胎兒神經管畸形，其機制尚不清楚，研究影響葉酸新陳代謝的遺傳變異可能有助于深入了解這一未知的保護機制。隨著目前對單核苷酸基因多態性(Single nucleotide gene polymorphism SNP)的研究，這些代謝途徑包括蛋氨酸循環、葉酸介導的一碳代謝途徑和同型半胱氨酸代謝途徑。通過基因多態性的檢測，進一步了解NTDs和與發育相關的各種遺傳標記之間的關聯性，有助于增進我們對NTDs發病機理的遺傳學認識。以下是參考對各自基因的基于群體的研究，選擇了目前研究最熱門的常見葉酸基因多態性與NTDS發病關系進行綜述，以期為NTDs的機制研究提供參考。

2 5，10亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與NTDs

5，10亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase MTHFR)是目前研究最多的葉酸代謝關鍵酶，MTHFR酶是一種黃素蛋白，在葉酸代謝過程中將5,10-亞甲基四氫葉酸轉化為L-5-甲基四氫葉酸，L-5-甲基四氫葉酸可以進一步進入甲基傳遞通路，其副產物參與同型半胱氨酸再甲基化為蛋氨酸。蛋氨酸是主要DNA甲基供體的前體，對DNA甲基化和基因調控非常重要，而甲基化又是胚胎形成和發育起著至關重要的角色。人MTHFR基因由12個外顯子組成，該基因定位于1號染色體短臂末端(1p36.3)，編碼70e77 kDa亞基的二聚體蛋白。MTHFR基因突變導致酶活性下降和蛋氨酸合成減少，甲硫氨酸是S-腺苷蛋氨酸(SAM)的直接前體，是參與組織發育和生長的細胞中重要的甲基供體。MTHFR基因最常見的遺傳變異是677C>T多態(Rs1801133)和1298A>C多態(Rs1801131)，它們分別導致丙氨酸轉化為纈氨酸和谷氨酸轉化為丙氨酸。

2.1MTHFR C677T:MTHFR C677T突變是一種常見的突變，位于第4外顯子，是MTHFR 677堿基對C+T替換，導致222位密碼子纈氨酸轉化為丙氨酸，是一種常見的降低該酶活性的多態性[4]。也是目前研究與NTDs最廣泛的基因變異。MTHFR C677T多態性流行病學隨地域、種族、年齡和性別的不同而不同。

Cai 等[5]對NTDs子代及健康人群進行基因檢測發現，在MTHFR多態性中，母親攜帶TT和CT基因型對子代NTDS的影響更大(OR=4.105，95%CI=1.271～13.258；OR=3.333，95%CI=1.068～10.400)。攜帶T等位基因的母親在子代中患NTDS的風險更高(OR=1.798，95%CI=1.070～3.021)。得出MTHFR基因多態性可能是NTDS的母體危險因素。Cai等[5]對中國有NTDs生育史的母親MTHFR C677T基因進行檢測發現，攜帶T等位基因的母親在子代中患NTDs的風險更高。Zhang等[6]對MTHFR基因多態性與出生缺陷和不良妊娠結局的關系進行薈萃分析發現MTHFR C677T與神經管畸形(OR=1.24；95%CI，1.08～1.42)，得出MTHFR C677T與神經管畸形相關。Nasri等[7]對突尼斯人群的基因多態性及NTDs的關系進行病例對照研究發現，MTHFR C677T是母體NTDs胎兒的保護因素，在父親組中，MTHFR C677T是NTDs的危險因素。所有，從目前研究結果來看，MTHFR C677T基因突變與胎兒神經管畸形發生密切相關，尤其在女性人群中基因突變將直接導致下一代發生胎兒神經管畸形的概率顯著升高。

2.2MTHFR A 1298C:MTHFR A 1298C 是第二個關于MTHFR多態性的研究，又叫MTHFR 1。該基因編碼100 kDa煙酰胺腺嘌呤二磷酸依賴的細胞質酶，在葉酸代謝中起重要作用。MTHFD1是一種至關重要的酶，特別是在快速分裂的細胞中，如發育中的胚胎，嘌呤和嘧啶不斷需要從頭合成DNA。MTHFD1基因1,958位核苷酸的常見SNPs導致G到A的轉變，導致酶合成酶區653位氨基酸的精氨酸到谷氨酸的替代。MTHFD1基因的表達是由一個無TATA、無啟動子的啟動子控制的，轉錄是在126bp的多個起始點啟動的轉錄起始。MTHFD1主要位于細胞質中。甲硫氨酸循環專門定位于細胞質，是合成S-腺苷蛋氨酸(SAM)所必需的，SAM是許多轉甲基化反應的甲基供體，包括組蛋白和DNA甲基轉移酶(DNMTs)催化的反應。在轉甲基化過程中，SAM被轉化為S-腺苷-L高半胱氨酸(SAH)，SAH水解酶(SAHH)進一步將其加工成腺苷和同型半胱氨酸。Hcy通過5甲基四氫葉酸(5-CH3-THF)依賴的蛋氨酸合成酶的甲基化活性被循環為Met，并可用于新一輪的SAM合成。MTHFD1的少部分存在于細胞核中，在那里它對胸苷酸的生物合成和對葉酸缺乏后的DNA損傷反應的保護是關鍵的[8,9]，當MTHFD1基因表達的減少可能導致可用于嘌呤和胸苷酸合成的MTHFD1酶水平降低，這種情況在胚胎發育過程中對從頭合成DNA的需求增加的時候是非常有害的。

Dutta等[10]在印度東北部對醫療保健機構收治的前腦膨出的病例對照研究中證實，MTHFR 1298A>C多態性是人群中不良事件最顯著的相關危險因素。與健康對照組相比，MTHFR 1298CC基因型兒童的風險高4倍。當MTHFD1多態性與MTHFR單倍型的關聯時，其表現出顯著的加性效應(X2=6.29,p=0.01)。Cai等[7]對突尼斯NTDs的父母與MTHFD1基因多態性進行病例對照研究發現，攜帶A基因型和A等位基因的母親患NTDS的風險增加(OR=2.600，95%CI=1.227～5.529；OR=1.847，95%CI=1.047～3.259)。在Nasri等[7]的數據甚至得出突變等位基因和基因型對母親的保護作用。在父親組中，未發現MTHFR A1298C與NTDs的發生有關。關于MTHFR A 1298C與NTDs存在爭議，且MTHFR A 1298C受種群遺傳結構差異基因多態性不同，需要高質量薈萃分析進一步明確該基因在NTDS中的作用及意義。

3 蛋氨酸合成酶基因多態性與NTDs

蛋氨酸合成酶(Methionine synthase MTR或MS)是含有鈷胺(維生素B12)輔助因子，催化甲基從5-甲基四氫葉酸(5-CH3-THF)轉移到鈷丙氨酸生成甲鈷胺。它將這個甲基轉移至甲基化同型半胱氨酸形成蛋氨酸，這一過程對于維持細胞內充足的四氫葉酸和蛋氨酸是必不可少的。蛋氨酸作為該途徑的產物，是表觀遺傳機制所需的通用甲基供體S-腺苷甲硫氨酸的直接前體。MTR是唯一使用5-甲基-四氫呋喃的酶，缺乏MTR或MTR活性降低會導致5-甲基-四氫呋喃的積累，不能用于葉酸依賴的反應，如參與NTDs發病的嘌呤和嘧啶的合成。因此，MTR是一碳代謝過程中所需的關鍵酶，是同型半胱氨酸代謝的關鍵，也是維持MTR處于活躍狀態所必需的。人甲硫氨酸合酶基因位于染色體1q43上。它的長度為105.24 kb，由33個外顯子組成。它產生約1265個氨基酸殘基，重140.5 kDa，MTR一個常見多態性，位于核苷酸2756位(MTR 2756A> G)，它將天冬氨酸變成甘氨酸。研究證實MTR基因2756A>G多態性可以將天冬氨酸轉化為甘氨酸[11]。

Al Farra[11]對有代表性的491人進行基因檢測分析表明在整個約旦人群中MTR 2756A和MTR 2756G等位基因的總比例分別為90.73%和9.27%。約旦的MTR 2756基因型百分比分別為AA(83.5%)、AG(14.46%)、GG(2.04%)。美國的基因型分別為83.4%、15.4%和1.2%[12]，中國和韓國的不同基因型的平均百分比為 71.9%、23.3%[13]。Wang等[14]對MTR與NTDs的薈萃分析中得出MTR2756A>G與NTDS易感性相關(G與A：OR=1.45(1.06～1.98)，P=0.021；GG+AG與AA：OR=1.51(1.02～2.23)，P=0.038)。Gueant-Rodriguez等[15]對意大利40名脊柱裂兒童和58名對照組進行基因聯合分析發現，MTR 2756 AG/GG、TC 777 CG/GG/MTHFR 677 CC和MTR 66 GG/MTHFR 677 CC基因型增加了兒童脊柱裂風險，OR值分別為2.6(P=0.046)、2.4(P=0.028)和4.5(P=0.023)。Ouyang等[16]薈萃分析研究結果表明MTRA66G多態性不是高加索兒童NTD風險的預測因子。Al Farra[11]對約旦17例NTDs母親的分析結果顯示這兩個等位基因的多態性與NTD兒童產婦的風險增加之間沒有關聯。對MTR基因多態性多基于NTDs兒童患者基因檢測，存在選擇偏倚，對于預防NTDs發生我們需要進一步關于MTR基因多態性大樣本、多中心的臨床研究。

4 5-甲基四氫葉酸-同型半胱氨酸甲基轉移酶還原酶與NTDs

5-甲基四氫葉酸-同型半胱氨酸甲基轉移酶還原酶(Methionine synthase reductase MTRR)，是在MTR催化的再甲基化過程中，將5-甲基四氫葉酸的甲基轉移到同型半胱氨酸上，在這種依賴鈷胺的反應中，在活細胞中，MTR在其周期中偶爾會失活，因為每2000個周轉中就有一次丙氨酸被氧化成丙胺。MTR通過將電子從NADPH轉移到FAD，再轉移到FMN，再轉移到丙氨酸，參與MTR的還原甲基化循環。在活性MTR的再生中，還原性甲基化是由酶本身催化的，S-腺苷-L-蛋氨酸作為甲基供體，通過還原系統傳遞電子。在人體內，還原系統涉及如上所述的NADPH(電子供體)和MTRR(傳遞電子)。由于蛋氨酸的合成需要由葉酸供體進行甲基轉移，因此MTRR的活性對葉酸代謝和細胞甲基化非常重要。MTRR變異等位基因已經在大約三分之一到一半的研究人群中被發現。人類MTRR基因位于染色體5p15.2-15.3。在MTRR中，位于66位核苷酸的多態性(MTRR A66G；rs1801394)可將異亮氨酸轉化為蛋氨酸殘基(I22M)而導致MTRR缺陷表現為降低其有效修復能力。

Wang等[14]對MTRR與NTDs的薈萃分析中得出MTRR A66G與NTDS的風險增加顯著相關(G等位基因與A等位基因的比值：OR=1.36(1.03～1.80)，P=0.028；GG+AG與AA：OR=1.60(1.05～2.43),P=0.027)。Nasri等[7]對突尼斯父母MTRA66G多態性與神經管缺陷的研究中得出MTRA66G基因變異對母體NTDS有保護作用。Wilson等[17]對加拿大的一項病例對照研究表明，與對照組相比，病例和病例母親擁有純合子突變基因型的可能性幾乎是對照組的兩倍，當與低水平的鈷胺聯合使用時，母親的風險增加了近5倍(優勢比(OR=4.8，95%CI=1.5～15.8)；兒童合并使用這種組合的風險為2.5(95%CI 0.63～9.7)。在MTHFR和MTRR純合子突變基因型聯合存在的情況下，兒童和母親的風險分別增加了4倍和3倍(OR=4.1，95%CI 1.0～16.4；OR=2.9，95%CI=0.58～14.8)。Quan Cai等[7]對突尼斯NTDs患者與MTRR基因多態性進行病例對照研究發現，G等位基因頻率在病例組明顯高于對照組(OR=1.763，95%CI=1.023～3.036)。Mohanraj 等[18]對NTDs患者胎盤與正常妊娠胎盤比較發現，在NTDs患者胎盤組織中MTRR表達異常增高(P<0.05)。從大量基礎及臨床研究中，我們認為MTRR基因多態性的變異可通過減少組織中的表達影響葉酸的吸收及代謝而導致后代NTDs的發生。

5 胱硫醚β合成酶基因多態性與NTDs

胱硫醚β合成酶(Cystathionine beta-synthase CBS)是一種細胞質中的同源四聚體，由551個氨基酸殘基組成，是一種磷酸吡哆醛依賴性酶。在維生素B6的催化下，CBS使絲氨酸與Hcy合成胱硫醚。人類CBS基因位于染色體21q22.3上，一些CBS基因多態性被認為是遺傳NTD的危險因素，如844ins68(Rs72058776)、T833C(Rs5742905)和G919A(Rs121964962)。844ins68在第8外顯子插入68bp，是研究最多的與NTD相關的CBS基因多態性之一。到目前為止，已有超過191個致病性CBS突變被記錄在案。這些突變中的大多數在歐洲血統的高加索人中被確認，而只有很少的來自非裔美國人或亞洲人的突變被報道。大約87%的CBS突變是錯義突變，不是針對CBS催化位點，而是導致不穩定的錯誤折疊蛋白缺乏正常的生物學功能，指定它們進行降解。此外，相當一部分CBS突變體對作為變構活性調節劑和蛋白質穩定劑的SAM結合反應減弱。

Shaw等[19]對加利福尼亞州259名患有脊柱裂的嬰兒及359名非畸形嬰兒的CBS基因檢測對比發現，CBS(Rs2851391)OR=2.0(1.2～3.1)；CBS(Rs234713)OR=2.9(1.3～6.7)，顯示CBS與NTDs的非隨機相關性的統計學證據。Houcher等[20]對阿爾及利亞NTDs有生育史的母親的CBS基因多態性的雜合基因型頻率與母親對照組相比有統計學差異(OR：3.72；95%CI：1.59～8.73)。Harris MJ[21]在動物實驗中發現CBS突變體小鼠神經管閉合正常。Ouyang S等[22]對CBS與NTDs的相關風險進行薈萃分析發現，母親、兒童和父親中CBS 844ins68多態性與NTD風險之間均無顯著相關性，得出CBS 844ins68多態性不是NTD風險的良好預測指標。R Zhao等[23]在NTDs母親和非NTDs母親之間在CBS基因中T833-C和G919-A突變的頻率方面沒有發現顯著差異。

關于CBS多態性變異與NTDs的基因多態性的研究中，研究的結果是相互矛盾的，導致這些多態性的臨床意義還不確定。分析原因是我們無法量化基因-環境和基因-基因的相互作用的影響，一些單核苷酸多態性的影響可以歸類為“不相關”，并進一步得出結論，其實它們在NTDs的發病風險可能沒有主效應，或者只具有與其他單核苷酸多態性相互作用的微乎其微的效應，導致NTDs的發生。建議在更詳細的分層和更大的人群基礎上進行進一步的研究，以研究CBS與NTDs的相關多態性。

6 甜菜堿-同型半胱氨酸S-甲基轉移酶基因多態性與NTDs

甜菜堿-同型半胱氨酸S-甲基轉移酶(betaine-homocysteine methyltransferase BHMT)以甜菜堿為甲基供體底物將同型半胱氨酸轉化為蛋氨酸。BHMT的四級結構為二聚體。對于每個單體，其中包含酶的活性位點和催化鋅位點。人類BHMT基因已被定位于染色體5q13.1-q15.2，分別由8個外顯子和7個內含子組成。人類BHMT基因可能產生比野生型更高的同型半胱氨酸親和力的酶。這種多態性可能在同型半胱氨酸的穩態中起關鍵作用。BHMT基因多態性還可能產生一種高效的變異，當與高葉酸水平結合時，這種變異會導致代謝周期過度運轉。在對照樣本中描述的等位基因頻率在美國是0.25～0.33，在加拿大是0.31，在波蘭是0.28和0.29，在羅馬尼亞是0.30，在中國是0.30，在荷蘭是0.31[24]。

王懿征等[25]對中國北方漢族兒童BHMT基因分型，結果BHMT基因rs3733890位點等位基因頻率與NTDs的發病存在顯著關聯，且攜帶A等位基因兒童發生NTDs風險高于G等位基因的兒童(OR=I.408，95%CI=1.013—1.95)。證明BHMT基因多態性與兒童NTDS易感性顯著相關。Cao等[26]在中國對 152名患有NTD的兒童進行了病例對照研究。結果證明NTD和BHMT基因中rs3733890的等位基因頻率有統計學差異(P = 0.041)，而A等位基因的患兒NTD的風險高于G等位基因(OR = 1.408，95%CI =1.013～1.956)。單倍型分析顯示BHMT的CAAA單倍型與NTD風險增加相關，但BHMT的CGAA單倍型可能降低NTD的風險。Shaw等[19]關于BHMT與NTDs的病例對照研究中，得出OR = 1.8(1.1～3.1)，證明BHMT與NTDS相關。特別是當母親服用未孕的葉酸或父母優先傳遞MTHFR rs1801133 T等位基因時，BHMT與NTDs顯著相關。BHMT與NTDs的關系得到證實，但目前對該基因在NTDs的作用機制上有更加深入的研究，但在臨床上，通過加強監測備孕婦女的BHMT的基因多態性從而指導臨床補充葉酸的非常有必要的。

7 二氫葉酸還原酶基因多態性與NTDs

二氫葉酸還原酶(Dihydrofolate Reductase DHFR)將胸苷酸合成過程中形成的二氫葉酸還原為四氫葉酸，從而刺激葉酸周轉，產生dTMP，進而合成DNA。這些過程對于細胞的快速生長和分裂都是必不可少的。充足的葉酸周轉對于DNA、RNA和蛋白質的適當甲基化都很重要。人類dhfr基因位于5q11.2，跨度超過30kb。一種常見的DHFR多態性包括位于內含子-1中19bp的缺失，該缺失位于DNA序列的非編碼部分，與調節DHFR的轉錄和翻譯有關，與脊柱畸形發生的風險相關，對胚胎發育至關重要，這可能是通過改變DHFR基因的表達來實現的[27]。

Johnson等[28]對脊柱裂家族成員及對照組人群提取DNA，分析DHFR內含子-1的19bp缺失多態性，結果顯示對照個體的基因型頻率與SB脊柱裂母親的基因型頻率差異有統計學意義(P=0.032)，但與脊柱裂患者及父親的基因型頻率無顯著性差異(P>0.05)。脊柱裂母親與對照組不同，缺失等位基因純合子的頻率增加，而雜合子的頻率下降。Paul 等[29]對62名NTDS胎兒的母親及73名健康嬰兒的母親的DHFR基因進行檢測，病例組野生等位基因頻率為63%，對照組為58%。病例組和對照組缺失等位基因頻率分別為37%和42%。病例組和對照組純合子+/+基因型頻率分別為41.94%和34.25%，雜合子+/-頻率分別為41.94%和47.95%。病例組-/-基因型頻率為16.13%，對照組為17.80%。通過共顯性、顯性和隱性模型，發現DHFR對NTDs風險不顯著。Prasoona等[30]通過采用以家族為基礎的三聯體研究設計，對來自印度泰蘭加納的124例NTD患者-父母三組(n=124x3=372)和184例健康對照-父母三組(n=184x3=552)進行DHFR 19bp缺失基因分型。證實了母體DHFR19bp缺失對胎兒無腦發育的強烈影響。母親缺失基因型(DD)和父親雜合缺失基因型(WD)的交互作用與神經管畸形的風險相關，提示在神經管畸形的病因研究中應同時考慮父親的遺傳效應和母體的遺傳效應。雜合缺失基因型(WD)患者父母的血清葉酸水平明顯高于對照父母(P<0.05)。基因雜合缺失基因型(WD)患者的血清葉酸水平明顯高于對照父母。得出DHFR 19bp缺失可作為預測神經管畸形病因學預后的生物標志物。

8 總 結

NTDs是一種復雜的疾病，葉酸代謝相關基因多態性是導致基因功能或調控改變的DNA序列變異，直接導致疾病過程。然而，大多數葉酸代謝相關基因多態性可能對疾病的發病作用不大。于標記葉酸代謝相關基因多態性與實際功能葉酸代謝相關基因多態性之間的關聯性，它們作為遺傳標記可用于尋找功能性葉酸代謝相關基因多態性，編碼每種酶的基因的多態性與改變每種蛋白質的一級結構有關。未來旨在確定這些危險因素的研究必須以更廣泛的視角來處理這個問題，包括幾個基因，并收集盡可能多的環境數據。盡管有大量的臨床數據將NTDs與葉酸基因聯系起來，葉酸在NTDs病因中的作用可能源于表觀遺傳效應或與非葉酸基因的相互作用。所有的研究都支持NTDs的多因素性質，強調了多種方法的必要性，以便理清導致這種復雜疾病的因素。