射血分數保留型心力衰竭動物模型的研究進展

李慧穎，繆 榮，肖湖南，白永懌，劉宏斌

1 解放軍總醫院第二醫學中心 心血管內科，國家老年疾病臨床醫學研究中心，北京 100853；2 解放軍醫學院，北京 100853；3 北京衛戍區朝陽第六離職干部休養所 門診部，北京 100027

自2016 年美國心臟病學會和歐洲心臟病學會將心力衰竭(以下簡稱心衰)分為射血分數減低型心 衰(heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF)、射血分數中間值的心衰(heart failure with mid-range ejection fraction，HFmrEF)和射血分數保留型心衰(heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF)以來，HFpEF 的發生率逐年增加，已發展成為心衰的最主要類型，臨床上半數以上的心衰為HFpEF[1]。起初人們認為HFpEF 是以高血壓、心肌肥厚和舒張功能障礙為特征的循環功能障礙，而目前來看，HFpEF 綜合了心、肺、血管、腎、脂肪組織、骨骼肌、免疫和炎癥等多系統功能紊亂[2-3]，有高血壓、心肌缺血、肥胖、糖尿病、血脂異常和衰老等方面的病因[4]。由于復雜的病理生理學特點、表型異質性和自然發病史，HFpEF 的治療一直無較大突破[5]，而建立符合人類HFpEF 發病機制的動物模型成為揭示新的信號通路和潛在治療靶點的關鍵。本文將從壓力負荷相關動物模型、缺血模型和代謝功能障礙模型方面對HFpEF 實驗動物模型的建立進行綜述，為實驗動物模型的選擇提供參考。

1 壓力負荷相關HFpEF 動物模型

早期的HFpEF 模型多模擬壓力負荷機制，這類模型動物的收縮壓升高，心臟后負荷增加，心肌肥厚且纖維化，心室舒張功能降低，心肌血流儲備受損，其早期左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)基本在正常范圍，雖然壓力負荷模型后期難免轉為HFrEF，但此類模型體現了HFpEF 的基本病因，再聯合其他要素則更貼合實際的HFpEF。常見的壓力負荷模型有Dahl 鹽敏感(Dahl salt-sensitive，Dahl/SS)大鼠模型、自發高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)模型、主動脈縮窄(transverse aortic coarctation，TAC)模型、腎性高血壓模型、激素相關的壓力負荷模型等。

1.1 Dahl/SS 大鼠 Dahl/SS 大鼠由SD 大鼠近親繁殖而來[6]，是遺傳性高血壓大鼠，同時也是常用的心衰動物模型。糖酵解代謝增強、氧化解偶聯異常、細胞外基質的改變、動脈內皮功能和心肌血流儲備受損、細胞凋亡增強是其發生HFpEF 的機制[7]。該方式無須手術，主要優點是能夠模擬HFpEF 患者壓力負荷下發病的慢性進程，缺點是容易轉為HFrEF[8-9]，需要經胸超聲或介入手段監測心臟功能障礙的變化。建模方法簡單，正常飲食(0.3%氯化鈉)喂養Dahl/SS 大鼠至7 周齡，而后轉用高鹽飼料(8%氯化鈉)喂養至13～14 周齡可建立HFpEF 模型[10-11]，此時心臟超聲證實其心肌肥大，舒張功能障礙，而左心室容量、LVEF未發生變化。此類模型適于HFpEF 心肌纖維化、室性心律失常、內皮功能障礙、炎癥等方面的研究[11-15]。

1.2 SHR SHR 是Wistar-Kyoto(WKY)高血壓大鼠的近交系，高血壓自發率100%，是常用的原發性高血壓及心衰的嚙齒類實驗動物[16]。從4～6 周齡開始，SHR 血壓逐漸升高，最高可達180～220mmHg (1mmHg=0.133)，16 周以后高血壓的相關并發癥形成，并且出現HFpEF 的心臟結構特點[17]，28～51周齡的衰老SHR 大鼠的舒張功能障礙發生進展性改變，而左心室收縮功能保留，52～53 周齡的SHR 大鼠其心內膜下膠原合成和沉積明顯增加，心電圖體現心肌缺血[18]。Holjak等[16]對SHR 種群建立近60 年來的表型改變進行了系統評價，認為目前的SHR 品系較以往世代能更好地模擬HFpEF 向心性肥厚的特點，適于相關的藥理學研究。但該模型對溫度、濕度、清潔度、光照等飼養環境要求嚴格，最初4～6 周不應給予任何應激刺激，乳鼠可飼喂用雞蛋和奶粉做成的蛋糕，后續飼養過程中也要防止肺部感染。

1.3 TAC 相關模型 TAC 誘發高血壓心肌肥厚和心衰的方法始于1991 年，通過在主動脈弓部用線結扎法形成精確的定量縮窄，達到限制血流、增加室內壓的目的。成模過程以小鼠為例，選用9～10 周齡雄性小鼠，重度縮窄(28 G)后2～3周即可發展為心衰，中度縮窄(27 G)后4～6 周也可以發展為心衰[19]；縮窄部位也可選用腹主動脈等部位[20]。目前TAC 與醋酸去氧皮質酮(deoxycorticosterone acetate，DOCA)慢性刺激共同誘導的小鼠模型較多地用于基礎研究[21-23]。此類模型早期呈現向心性肥厚和舒張功能障礙，心肌血流儲備減少、冠狀動脈內皮功能減弱、能量代謝異常，后期亦會發生心室擴大、室壁變薄和射血分數減低，故術后應及時、定期地進行心臟超聲等監測。Wallner 等[24-25]對2 月齡雄性美國短毛貓的主動脈進行部分結扎，持續壓力負荷4 個月后呈現HFpEF 特點，并有NT-proBNP 水平升高、肺動脈高壓和肺功能受損，更好地體現了HFpEF 的心肺功能特征。該方法也可用于建立小型豬等大型動物的HFpEF 模型。

1.4 腎性高血壓模型 由Page[26]最早提出的腎外包繞是常用的腎性高血壓建模方式，建模方法為手術準備并鈍性分離動物腎以后，用玻璃紙、乳膠薄膜、絲綢、火棉膠等材料繞腎門將腎交叉包繞。腎外包繞引起腎周圍炎，在腎外逐漸形成一層纖維素鞘膜，壓迫腎實質，造成腎缺血，激活腎素-血管緊張素系統，進而引起血壓升高和舒張功能障礙。建模時可對模型動物進行單側或雙側腎包繞，模型動物可選用鼠、豬、犬甚至靈長類動物等[27]。Munagala 等[28]率先用此模型進行了針對HFpEF 的大動物研究，研究表明雙側腎包繞導致老年犬的動脈僵硬度增加，并且與左心室質量增加和纖維化有關。此類模型進展較慢，適合長時間深入的以及衰老相關因素的研究。此外有單側腎全部或部分切除的造模方式，如Primessnig等[29]切除雄性Wistar 大鼠單側腎大部(5/6)建立慢性腎功能不全和HFpEF 模型，此外也有造成腎動脈狹窄的腎性高血壓建模方式[30]。該類模型左心室肥大，左心室松弛時間常數延長，左心室舒張末期壓力增加，肺質量增加(肺淤血)，NT-proBNP 增加，左心室收縮功能保留，符合HFpEF 的臨床特點，但手術操作相對復雜。

1.5 激素相關的壓力負荷模型

1.5.1 單純激素誘導的壓力負荷模型目前較少應用 腎上腺素對心臟β 腎上腺素能受體的長期慢性刺激以及血管緊張素/鹽皮質激素對血管平滑肌、水鈉平衡的長期影響是此類模型的建模機制。早期Mori 等[31]通過皮下埋植微量滲透泵釋放血管緊張素Ⅱ[1.5 mg/(kg·d)]或苯腎上腺素[40 mg/(kg·d)]的方式，使得9 周齡雄性C57BL/6 小鼠出現向心性肥厚和舒張功能障礙，而其收縮功能正常；其研究表明激素通過cyclin-CDK/Rb/E2F 信號通路引起丙酮酸脫氫酶激酶4 上調進而抑制葡萄糖氧化可能是HFpEF 的發病機制之一。另有研究采用皮下釋放低劑量AngⅡ[0.2 mg/(kg·d)]的方法來建立前臨床階段的HFpEF 小鼠模型[32]。

1.5.2 激素聯合其他壓力因素可加速誘導HFpEF模型 激素聯合其他因素可加快成模時間，如上文提到的DOCA 與TAC 共同誘導的動物模型，又如DOCA 聯合單側腎切除并給予等滲鹽水加速壓力負荷的嚙齒類動物模型等[27]。鹽皮質激素DOCA通常通過皮下埋植微量滲透泵的方式給藥，聯合其他壓力負荷因素可使模型動物加速呈現心臟肥厚和纖維化、E/E’升高、等容松弛時間常數增加等舒張功能障礙。

1.5.3 激素聯合代謝因素可更好地模擬HFpEF 的臨床特征 給予長白豬DOCA(100 mg/kg) 90 d，同時給予其“西方飲食”(高鹽、高脂肪、高膽固醇、高糖)，可誘導建立HFpEF 大動物模型[33-34]。后續又有DOCA 和西方飲食基礎上聯合Ang Ⅱ(0.015 mg/h，微量泵)建立的成年雌性長白豬模型[35-36]以及DOCA 和西方飲食誘導的雌性哥根廷小型豬模型[37]等。這種激素聯合其他因素誘導的方式可在壓力負荷的基礎上模擬代謝綜合征因素，與臨床上HFpEF 多器官疾病共存的特點更相符，對嚙齒類動物同樣適用。

2 缺血模型

通過各種方式造成心肌缺血的動物模型可在一定程度上模擬HFpEF 的病理特征。上文提及的腎上腺素誘導法即可導致心肌耗氧增加和心肌相對缺血[38]，激素誘導的缺血模型可操作性強，周期短，大小型動物均適用，但不能精確定位梗死區域，與臨床心肌缺血有一定差異。冠狀動脈結扎法可模擬大鼠等動物的心肌缺血。中大型動物可利用Ameroid 縮窄環套于其冠狀動脈外、冠狀動脈左前降支內注入微栓塞球、左心室內注射月桂酸鈉等方式來構建缺血模型[39]。上述動物模型操作復雜、造價高、死亡率高，且常發展為HFrEF，可用于HFpEF 心肌缺血亞型的建模。

3 代謝綜合征模型

糖尿病、高血壓、肥胖、高脂血癥以及肺、腎等器官的功能不全常同時存在，在此基礎上發展而成的HFpEF 一定是多種因素促成的，近年來HFpEF 動物模型逐漸向代謝綜合征方向發展。

3.1 高脂血癥、肥胖和糖尿病模型能夠體現HFpEF 的代謝特點

3.1.1 高脂血癥和肥胖模型 脂質堆積和肥胖與高血壓、心肌缺血、心肌代謝紊亂密切相關。薛禮美等[40]嘗試利用HFD 喂養新西蘭白兔3 個月建立HFpEF 模型，此造模方法簡單，但歷時長，且病理變化程度不易控制，故有研究先用HFD 引起高脂血癥，而后聯合其他方式誘導HFpEF。如HFD 喂養SHR 大鼠構建高血脂合并高血壓的HFpEF 模型，又如HFD 聯合鏈脲佐菌素腹腔注射破壞胰腺構建高血脂合并糖尿病HFpEF 模型。事實上，HFD 引起的脂代謝紊亂和胰島素抵抗是HFpEF 的基礎病理特點，單純高脂血癥模型應用較少。

3.1.2 肥胖和糖尿病模型 糖尿病和胰島素抵抗狀態會增加氧化應激、促進微血管功能障礙以及炎癥反應，進而引起心臟結構和功能的改變，此為HFpEF 發生的重要機制[41-42]。一些基因敲除小鼠，如瘦素缺陷型ob/ob 小鼠以及瘦素受體缺陷的db/db 小鼠，既存在攝食過量、肥胖、高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗的特征，又存在HFpEF 的病生理特點。db/db 小鼠9 周齡開始呈現出左心質量和室壁厚度增加的特點，同時伴有活性氧產生增加、心肌間質纖維化，類似于糖尿病心肌病；5 月齡呈現出左心室舒張壓最大下降速率下降的特點，此時經胸心臟超聲可以證實其心臟收縮功能保留，而等容舒張時間延長，E/A 下降，與舒張性心衰的特征一致[43]。Monma 等[44]發現20 周齡的db/db 小鼠e’、E/e’、舒張末期壓力容量關系、左心室松弛時間常數等舒張功能相關指標皆較同窩出生的對照組仔鼠(db/+)惡化，但其射血分數保留。ob/ob 小鼠也是一種肥胖和糖尿病動物模型，其左心室舒張功能發生障礙，E/A 下降，但可能發展為糖尿病心肌病。Zucker 大鼠是肥胖和高血壓的遺傳模型，包括瘦型和肥胖型兩個亞系，其中肥胖型Zucker 大鼠(不能表達瘦素受體)的特點類似于人類肥胖和2 型糖尿病早期階段，且其左心室質量和舒張功能障礙持續加重，左心室等容舒張時間延長，類似HFpEF 的特點。另外Zucker 肥胖糖尿病(Zucker diabetic fatty，ZDF)大鼠是肥胖型Zucker 大鼠中能夠發展為嚴重Ⅱ型糖尿病的大鼠，常合并輕度高血壓，左心室質量增加不甚顯著，但存在舒張功能障礙；日本大冢黃褐鼠德島肥胖(Otsuka long-evans tokushina fatty，OLETF)大鼠等糖尿病模型[45-46]亦與HFpEF 特征相似。

3.2 ZSF1 大鼠是常用的HFpEF 代謝綜合征模型ZSF1 動物模型建立在上述Zucker 糖尿病大鼠之上，為目前流行的HFpEF 動物模型[47-49]。它由Zucker 糖尿病肥胖大鼠與自發高血壓心衰大鼠(由SHR 與瘦素受體基因突變的肥胖型SHR)交配而來。5 月齡的ZSF1 大鼠綜合了肥胖、高血壓、高脂血癥、左心室肥厚和舒張功能障礙、左心房擴張、心肌纖維化、腎功能障礙、NO 信號通路減弱、大動脈硬化、運動不耐受、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)升高等與人類頗為相似的特點，且其LVEF 保留[49-50]。雄性與雌性ZSF1 大鼠均可呈現類似HFpEF 的心臟功能障礙[51]，Goto 等[52]研究發現，雌性ZSF1大鼠、雌性Dahl/SS 大鼠以及雄性TAC/DOCA 誘導的小鼠都能體現LVEF 相對“保留”、左心室舒張末期內徑增大和E/e’增大等特點，但32 周齡的雌性ZSF1 大鼠與人類HFpEF 重合度更高，體現在其骨骼肌組織與人類HFpEF 患者在肌萎縮相關蛋白標志物表達(泛素蛋白酶體系統中的肌肉特異性環指蛋白1 以及自噬信號通路中的蛋白LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值)、線粒體代謝(琥珀酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、孔蛋白表達)方面特征類似，而另外兩類模型動物則不能呈現出這些人類組織相似點。Franssen 等[53]的研究發現，ZSF1 肥胖大鼠與人類HFpEF 都存在冠狀動脈微血管內皮細胞的激活和氧化應激。因此在研究HFpEF 運動不耐受特征的骨骼肌表現、心臟微循環代謝、線粒體代謝等生理機制時更傾向于用此模型。

3.3 HFD 與NOS 抑制劑共同誘導的“雙重打擊”模型迅速流行 2019 年Schiattarella 等[54]闡述了一種新的HFpEF 造模方法，他們利用HFD(60%脂肪功能)和充足的Nω-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽(Nω-nitro-L-arginine methylester hydrochloride，L-NAME)飲水(0.5 g/L)，使得C57BL/6N 小鼠模擬了HFpEF 的眾多代謝特征：HFD 導致體質量增加、糖耐量下降；L-NAME 為NOS 抑制劑，會引起內皮功能障礙性血壓升高、動脈僵硬度增加、冠狀動脈內皮功能受損、冠狀動脈血流儲備減少。HFD + L-NAME 組模型小鼠有心肌肥大、心肌纖維化、心臟舒張功能惡化并伴有肺充血，甚至運動耐量下降的特點，非常接近真實的HFpEF。事實上，L-NAME 更多地抑制了模型動物 的 內 皮 型NOS(endothelial NOS，eNOS)，其iNOS 的轉錄和蛋白水平反而有所上升，而HFpEF 患者和ZSF1 肥胖大鼠也有心血管系統iNOS 水平的升高。Schiattarella 等[54]利用此模型揭示了iNOS 誘導的IRE1α-Xbp1s 通路失調可能是HFpEF 的發病機制。此造模方式簡單，成模時間短(5～15 周內HFpEF 表型得到展現)，模型穩定(超聲心動圖顯示HFD + L-NAME 處理組的LVEF 保留時間長達1 年)。陳驍楠等[55]參照此方法建立了HFpEF 模型，他們給予8 周齡雄性和雌性C57BL/6J 小鼠60%高脂飲食以及0.5 g/L 的L-NAME 飲水，16 周齡模型小鼠組的E/A 比值、E/E'比值和左心室整體長軸應變均較同性別對照組高，24 周齡模型組小鼠的LVEF 仍與對照組保持一致，且呈現出心肌細胞肥大、心肌間質纖維化和左心室重構的基本特征。此動物模型的缺點是不能模擬HFpEF 患者高容量和高鹽負荷的特點，進行相關機制研究時應注意NOS 抑制劑在促進內皮功能障礙和炎癥因素的同時打破了氧化與亞硝基化的平衡。

3.4 HFD 聯合衰老和壓力因素的“多重打擊”模型可更好地模擬HFpEF 的慢性發病機制 Deng 等[56]高脂飲食喂養3 月齡小鼠13 個月，并在最后1 個月時向其腹腔內注入去氧皮質酮新戊酸酯(DOCP，75 mg/kg)來加速高血壓和系統炎癥，從而建立高脂、衰老和鹽皮質激素“三重打擊”HFpEF 模型。此模型呈現病理性心肌肥厚、舒張功能不全、高血壓、內皮依賴性血管舒張功能減弱、氧化應激和炎癥反應增加、運動耐量下降、膠原沉積增加、間質纖維化增加、肺質量增加、回心血量下降、心排血量下降等特點，但其LVEF 維持不變；該團隊利用此模型證實β 羥基丁酸能夠減少NLPR3 炎性小體的生成、減輕線粒體高度乙?；?、改善HFpEF 心肌纖維化。Withaar等[57]于2021 年建立了高脂-衰老-血管緊張素Ⅱ“三重打擊”模型，即給予18～22 月齡的老年C57BL/6J 小鼠HFD 3 個月，同時在給予HFD 的最后1 個月經皮下微量滲透泵給予血管緊張素Ⅱ[1.25 mg/(kg·d)]，從而使小鼠表現出HFpEF 的特點；該團隊利用此模型探究了利拉魯肽和達格列凈對HFpEF 的藥用價值。融合了衰老因素的模型喂養時間長，但適合血管內皮和微循環、炎癥、心肌重塑和衰老相關病理機制的研究。

4 結語

壓力負荷是經典的HFpEF 造模方式，但單純高血壓心肌肥厚不再是最常見的HFpEF 表型，壓力負荷聯合肥胖、糖尿病等代謝因素的復合模型更優；代謝功能障礙模型更貼近HFpEF 的特征，是目前主要發展方向。不同階段的HFpEF 生物學表現差異顯著，目前沒有任何一種模型能夠完美模擬人類HFpEF 的發生、發展進程，研究者應結合研究目標選用相應的誘導方式以得到合適表型。HFpEF 治療相關的研究應在不同的動物模型中均有效，包括一些與人類更貼近的大動物模型。