多形性膠質母細胞瘤中RAD18的表達及其與放射抵抗的關系

【摘要】 目的 探究多形性膠質母細胞瘤中RAD18的表達及其與放射抵抗的關系。方法 選取2019年8月至2020年8月收治的50例放射治療后復發及50例放射治療后未復發的多形膠質母細胞瘤患者作為研究對象，將人腦膠質瘤細胞系（A172）分別轉染空白和裝有RAD18的質粒載體，應用克隆實驗檢測經相同劑量射線照射后兩組細胞增殖情況，對放射治療后復發性多形性膠質母細胞瘤樣本中RAD18 mRNA的表達情況進行檢測，探討RAD18與多形膠質母細胞瘤放射抵抗的相關性。結果 在RAD18蛋白表達上，A172與正常人星形膠質細胞（NHAs）比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）；在轉染后的RAD18蛋白表達上，轉染裝有RAD18質粒的A172比轉染空白質粒載體高（Plt;0.05）；在γ射線照射后細胞克隆形成數量上，轉染裝有RAD18質粒的A172比轉染空白質粒載體RAD18多（Plt;0.05）；復發性多形膠質母細胞瘤的RAD18蛋白表達比原發性多形膠質母細胞瘤高（Plt;0.05）；RAD18與多形膠質母細胞瘤放射抵抗呈正相關（r=0.608，Plt;0.05）。結論 對多形性膠質母細胞瘤采取放射治療時會導致DNA損傷，增加RAD18表達，導致DNA的修復能力得到極大提升，進而引起患者放射抵抗，因此臨床在放射治療過程中對RAD18進行抑制，能提升治療效果。

【關鍵詞】 膠質母細胞瘤；放射療法；影像引導；RAD18；放射抵抗；復發

【中圖分類號】 R 730.264 【文獻標識碼】 A

The Expression of RAD18 in Glioblastoma Multiforme and Its Relationship with Radioresistance WANG Zhihan，ZENG Hongjun*

Shanghai Pudong Hospital，Shanghai 201300，China

*Corresponding author：ZENG Hongjun，Associate chief superintendent nurse；E-mail：lcxsjo@126.com

【Abstract】 Objective To explore the expression of RAD18 in glioblastoma multiforme and its relationship with radioresistance. Methods Selected 50 patients with recurrence after radiotherapy and 50 patients with glioblastoma who did not relapse after radiotherapy received from August 2019 to August 2020 as the research objects，and the human glioma cell line（A172）. The blank and plasmid vectors containing RAD18 were transfected respectively，and the cell proliferation of the two groups after irradiation with the same dose of radiation was detected by cloning experiment，and the expression of RAD18 mRNA in the samples of recurrent glioblastoma multiforme after radiotherapy was detected. To explore the correlation between RAD18 and radioresistance of glioblastoma multiforme. Results In the expression of RAD18 protein，the difference between A172 and normal human astrocytes（NHAs） was not statistically significant（Pgt;0.05）；in terms of the expression of RAD18 protein after transfection，the ratio of A172 transfected with RAD18 plasmid was Transfection blank plasmid vector is high（Plt;0.05）；after γ-ray irradiation，the number of cell clones formed is more transfected with RAD18 plasmid A172 than transfected blank plasmid vector RAD18（Plt;0.05）；recurrent polymorphic gel the expression of RAD18 protein in glioblastoma was higher than that in primary glioblastoma multiforme （Plt;0.05）；RAD18 was positively correlated with radioresistance of glioblastoma multiforme（r=0.608，Plt;0.05）. Conclusion Radiation therapy for glioblastoma multiforme can cause DNA damage and increase the expression of RAD18，which leads to a greatly improved DNA repair ability，which in turn causes radiation resistance in patients. Therefore，RAD18 is inhibited during the clinical radiotherapy.Can enhance the therapeutic effect.

【Key words】 Glioblastoma；Radiotherapy，image-guided；RAD18；Radiation resistance；Recurrence

膠質母細胞瘤又稱多形性膠質母細胞瘤，屬WHO Ⅳ級，是惡性程度最高的中樞神經系統腫瘤，預后差，確診后即使給予正規的治療（包括手術、放化療等），絕大多數患者的生存期仍少于1年，主要臨床表現為顱高壓癥狀（頭痛、惡心、嘔吐）及神經功能異常（癲癇、運動及感覺功能障礙）［1］。目前國際通行的標準治療方案為Stupp方案——即最大限度保護腦功能的前提下最大范圍手術切除腫瘤，隨后同步進行替莫唑胺（temozolomide，TMZ）放療及后續的TMZ化療，但未取得滿意的臨床治療效果。放射治療技術近年來進展很大，適性調強放射治療、圖像引導放射治療及最新的螺旋斷層放射治療系統等精確放療技術的應用，在保證了腦內重要器官照射劑量的同時，對術后瘤床區域達到放射治療劑量，從而提高了局部的控制率［2］。但即使如此，高復發率問題仍然無法有效避免，臨床還是有相當一部分患者在治療后出現復發，臨床已經證實其復發的原因與放射抵抗有關［3］。故本研究將2019年8月至2020年8月收治的50例放射治療后復發及50例放射治療后未復發的多形膠質母細胞瘤患者作為研究對象，探討RAD18與多形膠質母細胞瘤放射抵抗的相關性，報道結果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年8月至2020年8月上海市浦東醫院收治的50例放射治療后復發及50例放射治療后未復發的多形膠質母細胞瘤患者作為研究對象，本研究經過本院倫理委員會批準［批號：2019年審（22）號］，患者均簽署知情同意書。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），見表1。

納入標準：（1）患者意識清晰，無意識障礙；（2）病歷資料完整，中途未退出者；（3）患者均經過臨床診斷及檢查確診為多形膠質母細胞瘤，經影像學檢查及手術證實是否復發。

排除標準：（1）伴有不同程度認知障礙者；（2）近期急性、慢性感染者；（3）聽力障礙或者無法交流者；（4）預計生存期lt;3個月者。

1.2 方法

1.2.1 正常人星形膠質細胞及人腦膠質瘤細胞的培養 在DMEM細胞培養液（上海杰美基因醫藥科技有限公司提供）中放置A172（上海慧穎生物科技有限公司提供）細胞，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中孵育，培養液中含有的1%青鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司提供）、10%胎牛血清（上海雙洳生物科技有限公司提供）。將NHAs置于含重組人表皮生長因子（深圳市華生元基因工程發展有限公司提供）、氨基酸（金陵藥業股份有限公司福州梅峰制藥廠提供）、左旋谷氨酰胺（上海和序生物科技有限公司提供）、5%胎牛血清、胰島素（四環藥業股份有限公司提供）及GA-1000的培養基（上海甄準生物科技有限公司提供）中孵育。

1.2.2 Western blot檢測NHAs及A172中RAD18蛋白質表達 分別收集正常人星形膠質細胞及膠質瘤細胞，利用冰磷酸鹽（PBS，北京Solarbio生物科技有限公司）對其漂洗2次，加入美國CellSignaling公司生產的RIPA裂解液后于5 min冰上靜置。展開超聲破碎細胞，隨后將其離心30 min，應用Bradford試劑盒（北京天根生化科技提供）對RAD18蛋白濃度進行檢測，電泳后將膠轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF，美國Thermo Scientific公司提供）膜上。膜上加入1：250稀釋的上海瑤韻生物科技有限公司提供的鼠抗人RAD18一抗，洗膜將艾美捷科技有限公司提供的經1：1 000稀釋的羊抗鼠Ig G二抗加入其中，再次孵育，觀察信號時使用增強化學發光免疫分析技術。

1.2.3 A172細胞系轉染及細胞克隆實驗 （1）參照Lipofectamine 2 000轉染試劑盒說明書，用EDTA將空白質粒載體A172細胞及A172細胞系轉染裝有RAD18的質粒載體消化成細胞懸液，接種于6孔培養板中孵育，當細胞生長至80%融合時，加入4 μg預裝AD18的美國Addgene公司提供的pc DNA3.1質粒轉染膠質瘤細胞。對其進行孵育48 h，在DMEM細胞培養液中加入美國Sigma公司提供的新霉素衍生物Geneticin（G418）600 μg/ml。孵育4周后，對有抗性的細胞進行篩選。用Western blot檢測兩組RAD18變化。（2）以1×103/孔的密度將已轉染裝有空白質粒載體的A172及RAD18質粒載體細胞接種于6孔培養板中，對其進行2 Gyγ射線照射。放入培養基中孵育10～14 d，每3 d更換一次培養基。當克隆出現時，終止孵育。克隆的標準為超過50個的孤立細胞群，計算克隆形成數量，滴入結晶紫染色。

1.2.4 qRT-PCR對比原發及復發GBM標本中RAD18 mRNA的表達情況 采用試劑盒提取組織標本中的總RNA，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。總RNA應用隨機引物經逆轉錄酶催化成c DNA。PCR擴增條件：95 ℃溫度下預變性3 min，然后于95 ℃變性10 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，一共進行40個循環。

1.3 觀察指標 嚴格按照試劑盒說明書，對原發性及復發多形膠質母細胞瘤標本中的RAD18 mRNA表達情況進行實時熒光定量對比，總RNA采用試劑盒提取。RAD18引物序列：下游引物5'－TTACTGAGGTCATATTATCTTC－3'，上游引物5'－TTCACAAAAGGAAGCCGCTG－3'。內參GAPDH的引物序列：下游引物5'－GAAGATG-GTGATGGGATTTC－3'，上游引物5'－GAAGGT－GAAGGTCGGAGTC－3'。利用2－△△CT計算分析，以GAPDH的表達量為內參，對基因表達水平變化進行統計。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗，RAD18與多形性膠質母細胞瘤放射抵抗采用相關分析。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RAD18在人腦膠質瘤細胞及星形膠質細胞中的表達 應用Western blot方法檢測RAD18蛋白顯示，A172細胞系中RAD18蛋白表達（0.17±0.01）與NHAs（0.18±0.01）比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），見圖1。

2.2 轉染RAD18質粒或空白對照質粒載體的A172細胞系中RAD18蛋白的表達 經轉染裝有RAD18質粒的A172細胞的RAD18蛋白表達（0.93±0.10）高于轉染空白質粒載體組的RAD18蛋白表達（0.20±0.02），差異有統計學意義（Plt;0.05），見圖2。

2.3 A172、NHAs的RAD18蛋白表達水平 A172在RAD18蛋白表達（0.17±0.01）與NHAs（0.18±0.02）比較，差異無統計學意義（t=3.162，P=0.002）。

2.4 轉染后RAD18蛋白表達 轉染裝有RAD18質粒的A172（0.89±0.08）比轉染空白質粒載體RAD18蛋白表達（0.24±0.02）高，差異有統計學意義（t=55.737，P=0.001）。

2.5 γ射線照射后細胞克隆形成數量 在γ射線照射后細胞克隆形成數量上，轉染裝有RAD18質粒的A172（155.39±15.24）比轉染空白質粒載體RAD18（55.63±5.57）多，差異有統計學意義（t=43.474，P=0.001）。

2.6 復發性與原發性蛋白表達 復發性多形膠質母細胞瘤的RAD18蛋白表達（13.79±1.56）比原發性多形膠質母細胞瘤（7.28±0.73）高，差異有統計學意義（t=26.727，P=0.001）。

2.7 RAD18與多形膠質母細胞瘤放射抵抗的相關性 RAD18與多形膠質母細胞瘤放射抵抗呈正相關（r=0.608，Plt;0.05）。

3 討論

多行性膠質母細胞瘤為高級別膠質瘤，來源于神經上皮組織，是一種高度惡性、浸潤性、異質性和致命性的腦內腫瘤，在腦內腫瘤中發病率高達30%，超過50%的表現為WHO4級（多形性膠質母細胞瘤），該病治療效果差、復發率高、預后差，平均生存期18個月。臨床可表現為頭痛、抽搐及精神癥狀等［4-5］。

多行性膠質母細胞瘤好發于額葉、顳葉白質及大腦深部，其生長方式為沿白質纖維、腦膜等浸潤性或中央膨脹性生長、周圍浸潤性生長，由于血-腦脊液屏障破壞，血漿中的水及大分子物質從血管中溢出，因此常伴有瘤周水腫；其病理特點為瘤組織內見到明顯壞死灶，周圍瘤細胞呈柵欄狀排列，瘤細胞呈多形性［6-7］。放療是治療多行膠質母細胞瘤的必要手段，放射治療的靶標是腫瘤細胞的DNA分子，可殺滅殘存的腫瘤細胞及臨床亞腫瘤病灶、提高局部控制率和生存

率［8-9］。手術即使做到影像學上的全切除，生物學上仍有殘存的腫瘤細胞，因此多行性膠質母細胞瘤必須輔以放療［10］。鄭忠濤等［11］回顧性分析了年齡大于70歲的老年多行膠質母細胞瘤患者的臨床資料，結果顯示，接受術后放療患者的中位生存期為8個月，而僅接受放療患者的中位生存期為４個月，可見術后放療可明顯延長患者的生存期。但放射治療仍有復發情況，DNA損傷后的修復能力與腫瘤細胞對放射治療的有效性密切相關，復發的原因與腫瘤細胞對放射治療產生抵抗性有關。RAD18是一種單鏈DNA結合蛋白，在直腸癌、黑色素瘤、腦膠質瘤等多個惡性腫瘤中表達增加，具有泛素連接酶E3特有的典型RING結構［12-13］。為弄清RAD18與放射抵抗之間的關系，本次研究特選取與正常人星形膠質細胞表達量相近的A172細胞系。為了使細胞增殖能力明顯高于普通的A172細胞，本次實驗通過轉染的方式提升其表達水平，隨后進行同等劑量照射，以此來證明腦膠質瘤對放射治療的抵抗性與RAD18表達水平有關［14-15］。本研究顯示，A172在蛋白表達上與NHAs無明顯差異（Pgt;0.05）；轉染裝有RAD18質粒的A172顯著比轉染空白質粒載體RAD18蛋白表達高（Plt;0.05）；在γ射線照射后細胞克隆形成數量上，轉染裝有RAD18質粒的A172顯著比轉染空白質粒載體RAD18多（Plt;0.05）；復發性多形膠質母細胞瘤的RAD18蛋白表達顯著比原發性多形膠質母細胞瘤高（Plt;0.05）；RAD18與多形膠質母細胞瘤放射抵抗呈正相關（Plt;0.05）；復發性多形膠質母細胞瘤的RAD18 mRNA表達量顯著高于原發性，其原因可能在于放射治療不可避免引起DNA損傷，當患者進行放射治療時，RAD18與泛素結合酶RAD6結合形成二聚體，會對損傷起到修復作用，促使增殖細胞核抗原發生單泛素化，導致DNA的修復能力得到極大提升，減少了腫瘤細胞凋亡，這也是實驗結果顯示RAD18升高的原因，在此情況下，會導致多形膠質母細胞瘤患者產生放射抵抗，因此，若以RAD18為靶點，應用RNA干擾技術特異性抑制RAD18表達，可能會增強放療的效果。

綜上所述，對多形性膠質母細胞瘤采取放射治療時會導致DNA損傷，增加RAD18表達，導致DNA的修復能力得到極大提升，進而引起患者放射抵抗，因此臨床在放射治療過程中對RAD18進行抑制，能提升治療效果。

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（本文編輯：崔莎）