MicroRNA在喉癌調控機制中的研究進展

【摘要】 喉鱗狀細胞癌（LSCC）是頭頸部常見的原發惡性腫瘤；喉癌發生、發展的分子機制是探索有效診斷方法及治療策略的關鍵。尋找對喉癌早期診斷和干預有臨床意義的癌癥標志物一直是學術界熱門領域。近年來，越來越多的研究證實MicroRNA與喉癌的發病和進展密切相關；本文系統地論述了國內外相關文獻，總結分析與喉癌相關miRNA的相關分子機制及臨床意義并予以綜述。

【關鍵詞】 喉腫瘤；微RNAs；生物標記，腫瘤；分子靶向治療

【中圖分類號】 R 739.65 【文獻標識碼】 A

Research Progress of MicroRNA in Regulation of Laryngeal Cancer ZHAO Zhenzhen1，CHANG Miao1，HUANG Fuhui2*

1.The First Clinical Medicine College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030000，China

2.Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，the First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030000，China

*Corresponding author：HUANG Fuhui，Doctoral supervisor

【Abstract】 Laryngeal squamous cell carcinoma（LSCC）is a common primary malignant tumor of the head and neck. The molecular mechanism of laryngeal cancer is the key to explore effective diagnostic methods and therapeutic strategies. Searching for cancer markers with clinical significance for early diagnosis and intervention of laryngeal cancer has always been a hot field in the academic world. In recent years，more and more studies have confirmed that MicroRNA is closely related to the pathogenesis and progression of laryngeal cancer. In this paper，relevant domestic and foreign literatures were systematically reviewed，and the molecular mechanism and clinical significance of laryngeal cancer-related mirnas were summarized and analyzed.

【Key words】 Laryngeal neoplasms；MicroRNAs；Biomarkers，tumor；Molecular targeted therapy

喉鱗狀細胞癌（LSCC）是頭頸部常見的原發惡性腫瘤，全球每年發病人數約為27.6萬人［1］；早期喉癌的治愈率約80%，而晚期喉癌的5年生存率僅有50％左右［1］；喉癌發生、發展的分子機制是探索有效治療策略的關鍵。尋找對喉癌早期診斷和干預有臨床意義的癌癥標志物一直是學術界熱門領域；第一個miRNA發現于1993年［2］。近年來，隨著基因測序、轉錄和生物信息學的發展，越來越多的研究證實MicroRNA（miRNA）與喉癌的發病和進展密切相關［3］；表達異常的miRNA有望作為喉癌的早期診斷的新標志物，部分miRNA可能是喉癌治療的直接靶點。

1 miRNA概述

miRNA是由約22個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，其作用于mRNA，降解miRNA或阻止其轉錄、翻譯、調節其基因表達，可調節約1/3人類基因的表達［4］。miRNA可穩定存在于人體血清或血漿中，且表達模式、調控功能高度保守［5］。miRNA參與許多重要的生物學過程，如細胞增殖、轉移、凋亡等［3］。miRNA的表達失調是喉癌發生發展中一關鍵調控機制。

2 miRNA與喉癌的發生、發展

細胞增殖和凋亡之間的不平衡是致癌的一個重要原因。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，維持細胞存活和死亡的平衡，而miRNA是參與維持平衡的重要調控因子［6-7］。喉癌發生、發展涉及一種或多種miRNA的表達調控；近來許多研究證實，某些miRNA在喉癌中表達上調（表1），促進腫瘤細胞增殖，抑制細胞凋亡［8-14］；而部分miRNA在喉癌中表達下調（表2），抑制細胞增殖，促進細胞凋亡［15-45］。

2.1 促進喉癌細胞增殖進展、抑制喉癌細胞凋亡的miRNA miR-892a在患者喉癌標本和喉癌細胞系中表達上調，Dicer作為核糖核酸Ⅲ，用于成熟miRNA的制備，在調控細胞發育中起關鍵作用。DONG等［7］在小鼠模型中敲除miR-892a基因，通過CCK-8實驗和集落形成實驗證實，miR-892a的表達減少可抑制喉癌細胞的增殖和生長，Dicer在人喉癌樣本以及喉癌細胞系中的表達下調；生物信息學和雙熒光素酶報告基因分析發現Dicer 3'-utr是miR-892a的直接靶點，miR-892a可通過對Dicer的靶向抑制作用，促進喉癌細胞增殖和抑制細胞凋亡，發揮其致癌基因的作用。這項發現為研究喉癌的生物學分子機制提供了新的思路，為發現臨床新的診斷指標和靶向治療藥物提供了理論基礎。

miR-196b位于7p15.2染色體上HoxA9和HoxA10基因之間，屬miR-196家族，對胚胎發育和腫瘤發生至關重要；有研究表明，在頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）患者的唾液和組織樣本中miR-196b的水平顯著升高，CHENG等［46］對比了腫瘤和正常組織之間的miRNAs水平，以及健康組和HNSC組唾液樣本中的miRNAs水平，結果顯示HNSCC組中唾液腺miR-196b含量顯著高于健康個體，是一個突出的診斷生物標志物；LU等［47］發現miR-196b在鼻咽癌、口腔癌和食管癌患者中顯著升高；以上研究表明，miR-196b是頭頸部鱗癌的重要致癌miRNA。LUO等［8］基于qRT-PCR檢測發現，與相鄰正常組織比較，LSCC組織中miR-196水平上調、PCDH-17水平下調；Pearson相關分析顯示，miR-196b與PCDH-17的表達呈明顯的負相關（Plt;0.05）；DLRA結果表明，轉染miR-196b mimic+PCDH-17 3'UTR的細胞中熒光素酶活性可顯著降低；轉染PCDH-17 3'UTR + miR NC的細胞熒光素酶活性未見下降，說明miR-196b可靶向結合PCDH-17 3'UTR使其表達下調；隨著組織學分級、T、N、M分期的增加，miR-196b和PCDH-17的表達趨勢更為明顯。miR-196b可能通過靶向抑制PCDH-17，促進Hep-2細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制Hep-2細胞凋亡。

除了上述基因可促進喉癌細胞增值、抑制細胞凋亡外，miR-503可直接靶向抑制PDCD4基因及其編碼蛋白，促進喉癌腫瘤的生長和侵襲［11］；在波蘭人群中，miR-196a2單核苷酸多態性基因型rs11614913在喉鱗癌中過表達，可能是LSCC發生的潛在易感因素［12］；miR-155-5p可直接結合SOX10的3'非編碼區促進LSCC細胞的增殖和腫瘤的發生［13］。

2.2 抑制喉癌細胞增殖進展、促進喉癌細胞凋亡的miRNA 在眾多的腫瘤抑制因子中，miR-139-3p、miR-506在喉癌中的調控作用引起了人們的關注。miR-139-3p是miR-139家族的成員，被認為是一種潛在的腫瘤抑制因子；有報道稱miR-139-3p在乳腺癌、食管癌等腫瘤的發生發展中具有顯著抑制作用［48-49］。rab5a的過表達與腫瘤的惡性程度和轉移程度高度相關。近期，MA等［15］檢測了30例喉癌組織中miR-139-3p的表達水平；qRT-PCR結果顯示與癌旁組織相比，miR-139-3p在喉鱗癌中的表達下調；當SNU46細胞中的miR-139-3p表達上調時，rab5a的表達立即下調；上調miR-139-3p的表達后，SNU46細胞的增殖、遷移和侵襲均明顯受到抑制，同時加快了細胞的周期和凋亡；利用雙熒光素酶報告基因測定法顯示rab5a是miR-139-3p的直接靶點。由此可得miR-139-3p通過靶向調控rab5a抑制喉鱗癌的增殖、遷移和侵襲，阻斷細胞周期，誘導細胞凋亡，這為喉鱗癌的治療提供了一個潛在的治療靶點。

miR-506作為抑癌因子在喉癌組織中低表達，上調喉癌中的miR-506水平可抑制yap1的表達使細胞周期停滯在G1期，從而抑制細胞生長。YAP1在細胞G1期富集，是促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的轉錄調節因子，在LSCC中具有致癌作用［17］。GAO等［16］收集了62例LSCC患者和鄰近正常組織標本，通過qRT-PCR法分析miR-506的差異表達，免疫組化染色分析YAP1的差異表達，結果顯示LSCC組織中miR-506水平下調，YAP1的含量明顯較高；Spearman相關性分析證實，YAP1表達與miR-506表達呈負相關；TargetScan監測發現YAP1是miR-506的靶向調控目標；轉染miR-506后的TU-177癌細胞中YAP1的表達量明顯下調。

miR-506作為調控喉癌進展的上游基因，其失調可能廣泛影響LSCC發展中的許多細胞通路。這為探索喉癌發展的分子機制提供了新的思路，將促進喉癌新的診斷和治療策略的發展。

3 miRNA與喉癌的侵襲、遷移及預后

3.1 促進喉癌侵襲及遷移的miRNA miR- 632是一種新型癌癥相關miRNA。研究表明miR-632通過tff1依賴的方式加速血管生成，從而促進胃癌細胞的增殖和轉移［50］；miR-632可靶向調控MYCT1的表達促進肝癌的發生［51］。基于miR-632的這些生物學特性，越來越多的學者研究了其在喉癌組織中的作用，發現miR-632可促進喉癌Hep-2C細胞的增殖、遷移和侵襲，血清miR-632可作為診斷LSCC的一個新的有價值的分子靶點，也是喉癌總生存率的獨立預后生物標志物。

ZHOU等［12］初步檢測了10對喉癌組織及相應癌旁組織中miR-632的表達水平，發現miR-632在喉癌組織中明顯上調；功能研究結果表明，miR-632促進喉癌細胞增殖和集落形成，促進細胞遷移和侵襲，增強細胞增殖相關蛋白cyclin D1和c-myc的表達；TargetScan在線軟件和雙熒光素酶報告基因檢測證實GSK3是miR-632的直接靶點；GSK3是參與人類癌癥發生和進展的細胞信號通路的重要匯聚點；miR-632通過負向調控GSK3β（糖原合成激酶3β）促進LC細胞增殖、遷移和侵襲。

CAO等［52］檢測了162份喉癌血清樣本，發現LSCC患者血清miR-632水平明顯高于健康組；ROC分析法檢測兩組的血清miR-632水平，結果提示miR-632的高表達可以作為一種有效的血清診斷方法，另外發現血清miR-632表達升高與晚期N期、組織學分級和TNM分期相關，提示血清miR-632可能參與了疾病進程的發展，Kaplan-Meier生存分析顯示，血清miR-632高表達對總生存期（OS）和無病生存期（DFS）均有明顯影響，單因素和多因素分析證實，血清miR-632可能是LSCC患者DFS和OS和的獨立預后指標。

3.2 抑制喉癌侵襲及遷移的miRNA MiR-379位于染色體14q32.31上，在多種癌癥中差異表達［53-54］。miR-379可能在癌癥發展中發揮關鍵作用。TCF-4是由Wnt/β- catenin信號激活通路的關鍵轉錄蛋白，與β-catenin相互作用，介導多種基因的轉錄，調控細胞的分化、增殖、生存和凋亡［17］。有報道稱，上調TCF-4可促進喉癌的發生和發展。WEI等［17］測定了115例喉癌組織中miR-379的表達，與TCGA數據庫中的正常組織相比，喉癌組織及HEp-2喉癌細胞系中miR-379的表達水平降低，采用CCK-8法檢測轉染miR-379的HEp-2細胞的體外增殖能力，發現miR-379顯著抑制喉癌細胞生長；熒光素酶報告實驗驗證TCF-4是miR-379的靶基因，miRNA-379通過直接靶向TCF-4抑制喉癌細胞增殖和侵襲。

MiR-107位于10號染色體上，對應于泛酸激酶基因的內含子5。α2δ1蛋白是一個t型鈣通道亞基，Ca2+濃度對細胞增殖、凋亡和細胞周期調控至關重要。miR-107、CACNA2D1及其編碼蛋白α2δ1在LSCC組織中異常表達，表達水平呈負相關。miR-107可能通過抑制CACNA2D1的表達來抑制LSCC細胞的增殖和侵襲。HUANG等［55］發現轉染miR-107后的TU212和TU686細胞中CACNA2D1 mRNA的表達水平顯著改變，WB和qRT-PCR實驗結果顯示α2δ1蛋白及其編碼基因CACNA2D1 mRNA在LSCC組織中較正常組織高表達，miR-107在LSCC組織中的表達明顯降低，miR-107與CACNA2D1之間存在顯著的負相關。另外在LSCC患者中，MiR-107的表達與淋巴結轉移、腫瘤分化和原發部位相關。

HUANG等［56］基于TCGA數據庫分析了喉癌組織中差異表達的miRNA，發現了5種miRNA預后標志物（miR-100、miR-99a、miR-301a、miR-105-1和miR-383），通過對miRNA預后標志物的生存分析，篩選出關鍵的miRNA預后標志物miR-105-5p，有助于臨床醫生預測LC患者的預后，提高治療效果。

綜上可知，抑制喉癌侵襲和遷移的miRNA在喉癌組織中的表達水平下降；促進喉癌侵襲和遷移的miRNA在喉癌組織中的表達上升。有確定靶基因的miRNA有望成為藥物治療的有效靶點；在喉癌組織和健康個體的唾液、血清中存在差異表達的miRNA，可能成為喉癌早期診斷和預測預后的潛在生物標志物。

4 miRNA與喉癌組織的血管生成

血管生成平衡參與維持組織器官的正常生理過程，由血管生成刺激因子和抑制因子共同調控，影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、局部轉移［57］。來自腫瘤細胞、內皮細胞和周圍微環境細胞的miRNA通過調控腫瘤血管生成，起到促血管平滑肌生長或抗血管平滑肌生長的作用［58］。人們發現在血管生成的各個階段，miRNA能夠在信號通路內靶向調控多個基因，這使得其成為開發抗血管生成藥物的理想靶點。

POPOV等［59］通過微陣列技術分析了36個T4期喉癌患者的樣本中2 549個miRNA的表達水平，篩選出59個表達水平存在顯著差異的miRNA，其中與腫瘤血管生成相關的miRNA有11個：7個上調miR-1246，miR-181b 5p，miR-18a 5p、miR-21 3p、miR-210 3p、miR-503 5p、miR-93 5p，4個下調mir148a 5p、miR-145p、miR-204 5p，miR-125b 5p；MiR-148a 5p在晚期喉癌組織中表達顯著下調，且可通過促進喉癌組織的血管生成，加快腫瘤的增殖；POPOV還發現缺氧時，MiR-210是最穩定、最顯著的誘導microRNA，其靶向并促進血管內皮生長因子（VEGF）-A和VEGFR2，有趣的是其可抑制HIF-3α的生成；miR-210也受到HIF-1α/ HIF-2α的直接刺激。此實驗中某些miRNA影響腫瘤血管生成的具體機制仍不清楚，需要更多的實驗室結果來明確。

miR-140-5p已被證實在多種惡性腫瘤中下調或缺失。近年來有研究發現其可調節喉癌組織的微血管生成。VEGF-A是一種強效血管生成促進因子，可由腫瘤細胞、內皮細胞和支持細胞合成分泌。ZHANG等［18］研究了VEGF-A和miR-140-5p在喉癌組織中的表達譜，首次證實了miR-140-5p在喉癌中表達下調；且可靶向抑制喉癌細胞VEGF-A，抑制細胞侵襲和血管生成，進而抑制癌細胞增殖或侵襲。

SASAHIRA等［60］發現口腔癌中miR-126-5p水平降低可激活VEGF-A，從而促進血管生成和淋巴管生成；ISSIN等［61］通過測定miR-126在肺癌、口腔癌、喉癌中的表達水平發現，miR-126在喉癌中表達下調；這些研究結果對探索miR-126在喉癌的血管生成的機制提供了新的思路。

5 miRNA與喉癌的診斷

HMGA2基因位于染色體12q13-15上，編碼含有109個氨基酸的HMGA2蛋白，其已被認為是一種促進染色體易位和上調轉錄的致癌基因，有助于腫瘤的發生、侵襲和轉移。有臨床研究發現，喉癌組織中let-7a與HMGA2的表達呈負相關，說明let-7a對HMGA2可能具有靶向抑制作用；MA等［62］通過體內及體外實驗發現，喉癌組織中的miRNA let-7a可與HMGA2相互結合并抑制喉癌Hep-2細胞的增殖與遷移；let-7a的表達與LSCC患者的臨床TNM分期和淋巴結轉移呈負相關。并且ZHOU等［19］發現喉癌患者較健康人血清中let-7a水平下調，且喉癌患者血清let-7a與癌組織let-7a表達水平呈正相關。

由此可見，miRNA let-7a可能成為診斷喉癌的新的血清學標志物，且對喉癌的分期及預后的判定有重要的臨床意義。然而，目前對于血清let-7a具體作用機制尚不清楚可能是未來研究的重點。

6 miRNA與喉癌的靶向治療

LSCC治療通常以手術、放療和化療相結合為基礎，這些策略的優化可提高喉功能的保存率和早期腫瘤的5年生存率［63］。LSCC患者的常規化療是基于5-氟尿嘧啶、順鉑和多西他賽等藥物的聯合治療。然而，腫瘤耐藥性的出現加快了患者的早期復發和死亡。所以，除了識別腫瘤預測標志物外，還需要尋找新的藥物靶點來優化治療方案。miRNA可以調節與編碼耐藥性相關藥物靶蛋白的特定基因［64］。

阿霉素和順鉑目前已應用于LSCC臨床化療，LIN等［20］利用不同濃度的阿霉素或順鉑處理miR-936過表達的Hep-2指示細胞，Hep-2細胞的增值率與對照組相比顯著降低；驗證了miR-936的過表達提高了LSCC細胞對阿霉素和順鉑的藥物敏感性；此外，計算機算法預測得出GPR78是miR-936的直接下游靶點，過表達miR-936可以有效降低LSCC細胞中GPR78蛋白的表達。

此前有研究報道，LSCC中存在miR-21-5p和PDCD4之間的負性調控［65］。這種相互作用與5-氟尿嘧啶、順鉑、紫杉醇和多西他賽耐藥有關［66］，提示喉癌患者對順鉑的耐藥可能也與這種調節關系相關，但需進一步的研究來證實。LAPA等關于miRNA藥物靶點預測分析（Pharmaco-miR）揭示了目前用于LSCC治療的藥物靶點，包括順鉑和紫杉醇作用于由miR-21-5p調控的PDCD4，阿霉素作用于PDCD4和伊馬替尼靶向作用于分別由miR-181a-5p和miR-204-5p調控的FOS和SNAI2［67-69］。ACVR1C/ALK7低表達與許多惡性腫瘤的不良預后和化療耐藥有關（Principe）；LAPA等［67］通過檢測喉癌組織中ACVR1C的表達水平，得出ACVR1C與miR-376c表達水平呈負相關，提示miR-376c可能通過影響喉癌組織中ACVR1C的表達水平，降低順鉑治療的耐藥性。

另外，LSCC中TOP2A與miR-139-5p之間的表達水平呈負相關［67］，TOP2A異常調控與卵巢癌和乳腺癌中的蒽環類藥物耐藥性有關，這為探究喉癌治療中蒽環類藥物耐藥的機制提供了新的方向。

目前與喉癌相關的表達異常的miRNA種類較多，現將近年來的研究情況分別總結在表１和表２。

7 挑戰及展望

目前對于喉癌的早期診斷，一個主要的挑戰是識別敏感的、具有特異性的生物標志物，這些生物標志物有可能用于篩查、診斷和提供治療決策的價值。然而，將這些分子研究結果在臨床中直接使用仍存在一些挑戰。在miRNA家族中，個體成員表現出不同水平的miRNA表達，上述許多研究確實測試了使用miRNA的差異表達譜作為喉癌早期診斷的生物標志物的可行性，并篩選出了有前景的候選基因，這些結果可能最終有助于優化生物標志物列表，以便在早期階段簡單而準確地篩查疾病。

喉癌的發生、發展涉及多個miRNA及靶基因的失調，使用miRNA簇作為治療靶點，可以糾正整個通路或多種信號機制，理解miRNA簇調控的復雜性和生物學功能對于明確miRNA的臨床價值至關重要；對不同miRNA之間是否存在相互調控作用，是未來研究喉癌發生、發展機制的新方向。此外，在喉癌的機制研究中不僅要識別和驗證miRNA及其靶點，更重要的是發現對化療耐藥有效的miRNA模擬物或拮抗劑并應用于喉癌的治療。

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（本文編輯：楊允利）