無花果葉提取物對重癥肺炎大鼠的保護作用及機制的初步探討

徐志育，謝曉紅，朱 永，李 娜

0 引言

重癥肺炎(Severe pneumonia，SP)是一種急性呼吸道感染性疾病，也是全球范圍內常見的高死亡率疾病之一[1]。研究表明，包括H1N1、H5N1和H7N9在內的流感病毒可誘發SP，此外，還有一些細菌，如肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌也可引起SP[2-3]。SP病理機制復雜，嚴重影響了人們的生活質量，探索有效的治療途徑是治療SP的關鍵。

細胞間黏附分子-1(Intercellular adhesion molecule，ICAM-1)主要在支氣管和肺泡的上皮細胞以及間皮和內皮細胞間表達，是免疫球蛋白超家族的成員之一。ICAM-1可與細胞表面的β2整合素特異性結合，導致淋巴細胞與各內皮細胞的黏附性降低，減少細胞之間的信號傳導[4]。巨噬細胞炎性蛋白2(Macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)是由多種細胞響應感染或損傷而釋放的因子，能夠調節中性粒細胞的浸潤和微膿腫的形成[5]。已有研究表明，MIP-2與NF-κB結合后,與中性粒細胞發揮的作用密切相關，在呼吸道感染過程中參與了肺損傷的發展[6]。由此可見，消除這些引發炎癥感染的核心因子對于SP的治療至關重要。

無花果(FicuscaricaL.)屬于桑科無花果屬植物，其化學成分較多，具有較高的營養價值和藥用價值，此外，無花果葉也具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤以及降血脂血糖等作用[7-8]。而無花果葉對于SP是否也發揮作用未見報道，本研究觀察了無花果葉提取物對SP大鼠肺組織的影響,并初步探討其作用機制，以期為SP的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 65只SPF 級雄性 SD 大鼠，體重180～220 g，購于海南醫學院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 無花果葉提取物購自西安天瑞生物技術有限公司，肺炎克雷伯菌液由醫院檢驗科細菌室提供，IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α ELISA檢測試劑盒購自中國碧云天生物技術研究所，HE染色試劑和免疫組化染色試劑購自北京索萊寶科技公司，Trizol試劑購自美國Thermo 公司，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自日本TAKARA公司，PVDF膜與ECL發光液購自中國碧云天生物技術研究所，抗體ICAM-1、MIP-2、NF-κB p65、p65、p-IκBα、IκBα購自英國Abcam 公司，抗體辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG和GAPDH購自北京中杉金橋生物技術有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 重癥肺炎大鼠造模 取50只大鼠，術前12 h禁食不禁水，麻醉后頸部消毒并剃毛，無菌條件下將頸部皮膚切開，暴露上段氣管，用1 ml注射器經氣管注入 0.3 ml肺炎克雷伯菌液(生理鹽水稀釋約 3.6×108CFU/只)，將大鼠在固定臺直立保持20 s，以菌液分布均勻，縫合傷口，進行消毒。接種后，當大鼠出現行動遲緩、呆滯、呼吸急促等現象，且脈搏血氧儀檢測大鼠后足部血氧飽和度(SaO2)小于90 %，則判定重癥肺炎大鼠建模成功。

1.3 給藥處理 將建模成功的 45 只大鼠按照隨機數字表法分為模型組、低劑量無花果葉提取物組(低劑量組)及高劑量無花果葉提取物組(高劑量組)，另將15只未經任何處理的大鼠設為正常組，共4組，每組15只。低劑量組、高劑量組分別給予無花果葉提取物50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)灌胃，對照組和模型組均灌胃等量蒸餾水，連續8周，觀察期間大鼠自由攝食、飲水。

1.4 ELISA法檢測IL-4、IL-6、IL-10及TNF-α水平 實驗結束后，大鼠腹主動脈取血，室溫靜置2 h，于4 ℃離心機中以3 500 r/min 離心 15 min，分離上清液，按照ELISA試劑盒檢測方法，檢測各組大鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10 及TNF-α水平。

1.5 HE染色檢測肺組織病理變化 采血后處死大鼠，摘取肺組織，一部分固定在10%福爾馬林溶液中，一部分保存于-80 ℃冰箱。肺組織固定后取出，脫水透明，浸蠟過夜，進行常規石蠟包埋，切成厚度為4 μm的切片，脫蠟至水，加入蘇木精染色5 min，滴加鹽酸乙醇分化液分化數秒，氨水處理5 s，加入伊紅染色3 min，使用二甲苯透明、中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察肺組織病理變化情況并采集圖像。

1.6 免疫組化染色檢測ICAM-1和MIP-2表達 取制備的大鼠肺組織石蠟切片，脫蠟至水，在微波爐中進行高溫修復，滴加內源性過氧化物酶在37 ℃下孵育15 min，再使用5% 山羊血清在室溫下封閉1 h，將切片分別與稀釋的鼠抗ICAM-1(1∶200)、MIP-2抗體(1∶200)放在4 ℃下孵育過夜，次日，PBS洗滌，加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000)，加入 DAB 顯色后，蘇木精復染后洗滌，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并采集圖像，使用Image J軟件對圖像進行測定分析。

1.7 實時熒光定量PCR檢測ICAM-1、MIP-2 mRNA表達 取保存于-80 ℃冰箱的各組大鼠肺組織，剪碎后研磨勻漿，Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計檢測 RNA純度與濃度。逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR，GAPDH 作為內參基因。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性20 s，60 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸 45 s，循環 40 次，實驗重復 3 次。采用2-ΔΔCt 法計算各基因mRNA相對表達量。引物由上海吉瑪生物科技有限公司設計合成：ICAM-1 上游引物：5′-CGAATTCGGAGGTGCCCAGACGTC-3′，下游引物：5′-CCGCTCGAGTCAGGGTGTGGT-3′，MIP-2上游引物：5′-CCCAATGTCGCTCACTACTTCC-3′，下游引物：5′-CGTCAGCCCGTATGTCTTCC-3′，GAPDH上游引物：5′-GGCGTGAACCACGAGAA GTATAA-3′，下游引物：5′-CCCTCCACGATGCCAAAGT-3′。

1.8 蛋白質免疫印跡檢測NF-κB p65、p65、p-IκBα及IκBα 蛋白水平 大鼠肺組織加入預冷的RIPA 裂解液研磨裂解肺組織，以 12 000 r/min 離心 5 min，獲得上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取25 μg總蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳分離，將分離蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上。TBST 洗滌3 次，5%山羊血清進行封閉 2 h，洗滌并加入一抗抗體，在4 °C下孵育過夜。次日TBST 洗膜 3 次，加入二抗，室溫孵育2 h。TBST后，滴加ECL發光液進行顯影，采用Image J圖像分析軟件統計各條帶灰度值，以GAPDH為內參計算各蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠血清炎性細胞因子IL-4、IL-6、IL-10 及TNF-α含量比較 模型組大鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α含量較對照組均顯著增加(P<0.05)，IL-4的含量較對照組顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量無花果提取物組IL-6、IL-10、TNF-α的含量均顯著下降(P<0.05)，而IL-4含量顯著增加(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清中炎癥細胞因子表達情況(n=10,pg/ml)

2.2 各組大鼠肺組織病理學變化 對照組大鼠肺組織結構清晰，肺泡腔結構完整，間質無炎性細胞浸潤；模型組大鼠肺組織結構受損，肺泡萎陷，腔內有血滲出，肺泡間隔斷裂，可見大量炎性細胞浸潤；低劑量組、高劑量組大鼠肺泡腔滲血和炎性細胞浸潤等現象較模型組減輕，見圖1。

圖1 HE染色檢測各組大鼠肺組織病理學變化(100×)

2.3 各組大鼠肺組織ICAM-1和MIP-2免疫組化染色結果比較 對照組大鼠肺組織中染色較少較淺，ICAM-1陽性表達率低；模型組中ICAM-1陽性表達率較對照組顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組大鼠肺組織中ICAM-1陽性表達率顯著下降(P<0.05)，見圖2。

圖2 免疫組化染色檢測大鼠肺組織ICAM-1表達(100×)

與對照組比較，模型組大鼠肺組織中MIP-2陽性表達率顯著增加(P<0.05)；低劑量組與模型組之間MIP-2陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)，而高劑量組大鼠肺組織中MIP-2陽性表達率較模型組顯著下降(P<0.05)，見圖3。

圖3 免疫組化染色檢測大鼠肺組織MIP-2表達(100×)

2.4 各組大鼠肺組織ICAM-1和MIP-2 mRNA與蛋白表達比較 與對照組比較，模型組與低、高劑量組大鼠肺組織中ICAM-1、MIP-2 的mRNA相對表達量和蛋白相對表達量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量組大鼠肺組織中ICAM-1、MIP-2 的mRNA相對表達量和蛋白相對表達量均顯著下調(P<0.05)，見圖4、圖5。

圖4 qRT-PCR檢測大鼠肺組織中ICAM-1、MIP-2 mRNA表達水平

圖5 Western blot檢測大鼠肺組織中ICAM-1、MIP-2 蛋白表達水平

2.5 各組大鼠肺組織NF-κB p65、p65、p-IκBα 及IκBα蛋白表達比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織中NF-κB p65、p-IκBα蛋白相對表達量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量組大鼠肺組織中NF-κB p65、p-IκBα蛋白相對表達量顯著下降(P<0.05)，見圖6和表2。

表2 各組大鼠肺組織中NF-κB信號通路相關蛋白相對表達情況(n=6)

圖6 Western blot檢測大鼠肺組織中NF-κB信號通路相關蛋白表達

3 討論

重癥肺炎是一種常見的呼吸系統疾病，是各種傳染病中死亡的主要原因，如不進行適當的治療，可在數日內迅速引起呼吸衰竭、感染性休克甚至死亡。肺炎的嚴重程度取決于兩個過程，即免疫抵抗和組織適應力。免疫抵抗是指宿主通過減少、殺死或清除導致感染的活菌的能力。組織適應力是指病原微生物侵入機體時，宿主對病原微生物的承受或耐受能力。其中，抵御途徑是通過限制病原體或免疫抵抗途徑引起的損害來減少病理生理過程[9]。肺炎克雷伯桿菌是一種革蘭陰性致病菌，是肺炎常見的病原體之一，其進入下呼吸道后會引起肺泡毛細血管充血水腫，炎性細胞浸潤等現象[10]。本研究通過大鼠經氣管注入肺炎克雷伯菌液后發現，模型組大鼠肺組織結構受損，肺泡萎陷，腔內有血滲出，肺泡間隔斷裂，可見大量炎性細胞浸潤，這表明本研究中SP大鼠模型構建成功。

在本研究中，SP大鼠體內炎癥反應加劇，表現為血清中促炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α的含量升高，以及抗炎癥因子IL-4的含量減少。炎癥反應在SP的發生發展過程中發揮重要作用[11]。有報道，無花果葉具有抗炎作用。Che-Ahmad Tantowi等[12]的研究發現，無花果葉提取物通過抑制炎癥和軟骨降解酶來減輕絕經后骨關節炎的關節破壞。Zakaria等[13]的研究指出，無花果葉提取物通過抑制脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷中的促炎細胞因子而發揮抗炎的特性。此外，Joerin 等[14]通過構建高脂血癥大鼠模型，發現花果葉提取物干預6周后，可以明顯下調血清三酰甘油和 IL-6 水平，從而起到降低血脂的作用。本研究結果顯示，給予無花果葉提取物的大鼠，其肺組織中炎性細胞浸潤現象減輕，血清中IL-6、IL-10、TNF-α的含量均下降，IL-4的含量增加，表明無花果葉提取物能夠抑制SP大鼠的炎癥反應，起到保護肺組織的作用。

NF-κB是慢性炎性疾病中的重要轉錄因子，可調節多種炎癥反應，微生物產物和促炎細胞因子都可能觸發NF-κB途徑，并形成復雜的調控網絡[15]。本研究結果顯示，在注入肺炎克雷伯菌液后，大鼠肺組織內NF-κB p65、p-IκBα蛋白相對表達量均升高，同時通路相關因子ICAM-1和MIP-2表達增加，但經過一定劑量的無花果葉提取物治療后，肺組織內NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達受到明顯抑制，并且下調了ICAM-1和MIP-2的表達。ICAM-1是免疫球蛋白樣黏附分子超家族的成員，該家族介導白細胞與血管內皮的黏附，并參與多種心血管疾病，包括缺血-再灌注損傷、心肌梗死、動脈粥樣硬化以及其他一些疾病的發生與發展過程[16-17]。當呼吸道受到刺激或損害時，巨噬細胞和中性粒細胞可合成并分泌MIP-2，其進一步誘導炎癥因子發生浸潤，同時，在NF-κB激活后，可促進MIP-2的產生[18]。結果表明，無花果葉提取物對SP大鼠肺組織的保護作用可能與抑制NF-κB信號通路的激活相關。

綜上所述，無花果葉提取物能夠改善SP大鼠的肺損傷程度，抑制炎癥反應，其機制可能與下調ICAM-1和MIP-2的表達和抑制NF-κB信號通路激活相關，為研究無花果葉提取物在SP中的抗炎作用提供了新的思路。